新型分子印迹荧光传感器对海水中邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯的快速检测技术研究

潘俏芬 ,尤金杰 ,刘 华 ,陆 茵 ,孙爱丽* ,张泽明

（1.宁波大学 海洋学院,浙江 宁波 315823;2.宁波大学 食品与药学学院,浙江 宁波 315823）

随着社会的发展和经济的全球化,人类对塑料制品需求及使用量逐年增加,2018年全球塑料产量已达到3.6×108t[1].然而,塑料制品寿命普遍偏低,塑料垃圾通常会以工业及生活垃圾的方式排放到自然环境中进一步降解,释放大量的化学物质并迁移到环境中,造成严重的环境污染[2].

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Bis(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是一种常见的工业单体塑化剂,主要用于提升塑料制品的耐腐蚀性和柔韧性[3].作为常见的环境激素类污染物,DEHP 除了对环境造成沉重负担之外,还具有较强的生殖毒性[4].研究表明,DEHP 经人体呼吸系统和消化系统吸收后,能够导致生物体内分泌失调和紊乱,对人体生殖系统造成严重危害[5].此外,有研究证实孕妇暴露在含DEHP的环境中,会对胎儿有严重的致畸致癌作用[6].因此,中国及欧美等国家均禁止将DEHP用于儿童玩具及食品包装中[6].由于DEHP 与塑料制品之间常以非共价键结合,导致DEHP在塑料制品中可自由浸出,因此在生产和消费过程中很容易浸出,并通过大气沉降、地表径流等方式进入海洋系统[7].研究表明,在部分海域中DEHP 的污染已十分严重,对当地的水生环境和养殖系统造成了巨大的危害[7].我国于2002 年出台了相关法律法规限制DEHP 的使用,规定食品及环境中DEHP的限值为1.5 mg·kg-1[6].因此,对DEHP 进行实时监测和检测具有重要意义.目前,常见的DEHP 的检测手段有气相色谱-质谱联用、酶联免疫吸附法、高效液相色谱-质谱联用法等[8-10],但这些方法的预处理时间和检测时间较长,仪器维护费用较高.因此,亟须一种简单、快速、高效的DEHP 的分析检测方法.

分子印迹聚合物(MIPs)是一种具有与目标分子形状和大小互补的印迹孔洞仿生材料[11],除具有生物抗体良好的选择性和特异性外,MIPs 还具有良好机械稳定性、快速平衡动力学和良好的可重复使用性.将MIPs 锚定在量子点(QDs)上,获得的MIPs-QDs 纳米材料不仅具有规则均匀的形貌,方便功能基团的接枝,还具有QDs 优良的荧光检测性能[12].因此,基于MIPs 的荧光传感器的开发越来越受到关注.在各种荧光信号材料中,QDs 因其发光明亮、发光颜色可调、发光范围窄、光学稳定性高而成为最受欢迎的荧光信号材料[13].一些研究团队成功开发了基于MIP-coated QDs(MIP-QDs)的荧光传感器,具有对目标分析物高选择性敏感响应,这些MIP-QDs 在实际检测中显示出良好的应用潜力[14-15].本文通过制备基于DEHP的分子印迹聚合物,结合量子点优异的光电特性,开发了新型分子印迹荧光传感器用于海水中DEHP 的快速识别检测.通过表征传感器形貌结构、优化检测条件,构建了海水中DEHP 的荧光检测方法,并成功应用实际样品中DEHP 的检测.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所需试剂见表1.

表1 实验主要试剂

1.2 仪器与设备

荧光分光光度计(F-4600,日本日立公司);扫描电镜(SEM)(S-4800,日本日立公司);洛伦兹透射电镜(TEM)(H-7650,日本日立公司);傅立叶红外变换光谱仪(FT/IR-4700,日本株式会社日立制作所);X 射线光电子能谱(XPS)(ESCALAB 250 XiX,美国赛默飞公司).

1.3 实验方法

1.3.1 MIP-QDs 的制备

向50 mL 圆底烧瓶中加入8 mL 环己烷和2 mL表面活性剂Triton X-100,室温下以400 r·min-1磁力搅拌15 min.随后,将200 μL CdSe/ZnS 油溶性量子点(2.5 mg·mL-1,氯仿溶解)和60 μL TEOS 及200 μL 氨水(25wt%)依次加入烧瓶中,在400 r·min-1条件下搅拌2 h.与此同时,将200 μL DEHP(20 mg·mL-1,环己烷溶解)加入棕色小瓶中,依次加入200 μL 环己烷,36 μL APTES,并在400 r·min-1条件下充分搅拌2 h,进行模板和单体的预聚合.随后将预聚合溶液加入圆底烧瓶中,在黑暗条件下,以400 r·min-1磁搅拌12 h.

聚合反应结束后,向反应体系中快速注入10 mL 丙酮,震荡10 min,超声5 min 终止反应并破除乳液体系,在8.5×103g 条件下离心10 min,将离心去除上清液的聚合物用超纯水洗涤,去除反应不完全的APTES 和TEOS.最后,用洗脱液(V(乙醇):V(乙腈)=8:2)去除模板,超声10 min,震荡45 min.重复洗脱过程,直到LC-UV 在上清液中检测不到DEHP 为止.相应地,非分子印迹聚合物(NIP-QDs)是将200 μLDEHP 替换为相同体积的环己烷进行合成.

1.3.2 MIP-QDs 和NIP-QDs 的结构表征

采用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)对获得的MIP-QDs 和NIP-QDs 进行表面形貌表征.同时,通过傅里叶红外变换光谱(FT-IR)和X 射线光电子能谱(XPS)对获得聚合物进行官能团和元素解析.

1.3.3 MIP-QDs 的荧光响应分析

将制备的MIP-QDs 超声分散在乙醇中,配制质量浓度为25 mg·L-1的悬浊液用于荧光分析.向比色皿(1 cm×1 cm×2 cm)中加入900 μL MIP-QDs,采用F-4600 荧光分光光度计测定并记录其初始荧光F0,加入100 μL DEHP 孵育300 s 后,测定其荧光强度并记录其荧光强度为F.其荧光测定参数设置为: 激发波长(Ex)为340 nm,发射波长(Em)扫描范围为580～680 nm,光电倍增管电压750 eV,激发和发射夹缝宽度分别为5 nm 和10 nm.

通过Stern-Volmer 方程[16]评价MIP-QDs 的荧光猝灭效率:

式中:F0表示初始荧光强度;F表示加入DEHP 后,被抑制之后的荧光强度;KSV表示荧光猝灭常数;Q表示DEHP 的浓度.

以印迹因子IF 为指标,评价合成MIP-QDs 的荧光猝灭效率及其对DEHP 的选择性,IF 的计算公式如下:

1.3.4 实际样本的前处理

在象山港某入海口采集海水样本,将采集的海水经0.45 μm 的玻璃纤维膜过滤后移入顶空萃取小瓶中,加入内标后,固定在微萃取装置台上,并置入萃取针,在35 ℃条件下以500 r·min-1速度磁力搅拌40 min 进行萃取.随后,将萃取针插入GCMS/MS 进样口,以280 ℃热解吸2 min,GC 和MS设定参数参考文献[17].

2 结果与讨论

2.1 MIP-QDs和NIP-QDs合成体系的研究与表征

TEOS 的用量在很大程度上影响了MIP-QDs对DEHP 的印迹效应和特异性响应[18].如图1 所示,随着TEOS 用量的增加,添加DEHP 的MIP-QDs荧光猝灭程度先升高后降低,当TEOS 用量为60 μL 时,荧光猝灭程度最大为741,而未添加DEHP的NIP-QDs对DEHP荧光猝灭程度几乎一致,且远低于MIP-QDs.这些结果表明,MIP-QDs 对DEHP具有良好的识别效果和荧光猝灭能力.

图1 不同TEOS 用量的荧光猝灭效果影响

通过SEM 和TEM 对MIP-QDs 和NIP-QDs 进行形貌采集,结果如图2 所示.从图中可见,MIPQDs 和NIP-QDs 为表面粗糙,形貌均一的微球,直径约为(90±15)nm.同时,TEM 显示微球具有明显的壳核结构,表明量子点成功包埋进聚合物中.此外,SEM 和TEM 采集的聚合物在形貌和大小上没有明显差异,这是由于MIP-QDs 和NIP-QDs 的合成方法相同.

图2 MIP-QDs(A、a)和NIP-QDs(B、b)的扫描电镜和透射电镜图

为进一步验证关键基团是否成功接枝在分子印迹层上,通过傅里叶红外变换光谱(FT-IR)和X射线光电子能谱(XPS)对MIP-QDs 和NIP-QDs 的表面功能性基团和元素进行解析,结果如图3 所示.图3(a)显示,在795 和460 cm-1附近的振动峰则是由Si-O 的拉伸振动得到,1 061 cm-1处的特征峰为Si-O-Si 的伸缩振动,表明硅球已成功形成.在2930 cm-1处的伸缩振动一般被认为是-CH3和-CH2振动.此外,在3334 和1550cm-1处的伸缩振动峰值来自-NH/NH2化学键[19],表明APTES 中的特征基团成功接枝在硅球表面.MIP-QDs和NIP-QDs的FT-IR 谱图基本一致,表明聚合物成功被合成.图3(b)显示,150 eV 处的Si2s 峰、400 eV 处的Cd3d5/2峰、525 eV 处的O 峰、979 eV 处的O 峰揭示了MIP-QDs 上Si、Cd、O 的存在[20],进一步表明量子点被成功包埋在SiO2层中,形成壳核结构.MIPQDs 和NIP-QDs 的XPS 能谱显示出相同峰型,表明MIP-QDs 上的模板也成功被洗脱.

图3 MIP-QDs 和NIP-QDs 的FT-IR(a)和XPS(b)能谱图

2.2 MIP-QDs 荧光响应特性研究

MIP-QDs 与模板间的相互作用需要一定的反应时间,为获得最佳响应时间,将DEHP(20 mg·L-1,乙醇溶解)加入MIP-QDs 中连续扫描1 000 s,结果如图4(a)所示.向体系中加入DEHP 后体系荧光持续降低,孵育300 s 后,荧光强度基本稳定不变,表明此时MIP-QDs 与DEHP 之间达到动态吸附平衡.因此后续实验的孵育时间均设置为300 s.MIP-QDs浓度也是影响传感器检测的重要因素,过低或者过高的浓度均会导致传感器的线性和灵敏度[21].如图4(b)所示,随着MIP-QDs 质量浓度增加,MIPQ Ds对DEHP的荧光猝灭程度(F0-F)逐渐增大,在MIP-QDs质量浓度为25 mg·L-1时,荧光猝灭程度最高.分子印迹聚合物的特异性荧光猝灭反应受印迹层空腔空间构型的影响,体系中水的溶胀作用是影响检测灵敏度的重要因素[18].如图4(c)所示,水的存在显著影响了MIP-QDs 对DEHP 选择性,当水的比例达到80%时,MIP-QDs 对DEHP 的荧光猝灭效率最大,因此,后续实验中选择80%的水比例.强酸或强碱性环境对印迹层有明显的破坏作用,甚至电离印迹层,导致聚合物表面的识别为点被破坏[19].图4(d)显示,随着pH 的增加,MIP-QDs 对DEHP 的荧光猝灭效率呈先增加后降低的趋势,当pH 为8.0 时,KSV最高(数值为14.3),此时印迹因子(IF)为2.3,表明MIP-QDs 对DEHP 具有优异的识别能力.

图4 MIP-QDs 的孵育时间(a)、质量浓度(b)、水的比例(c)、体系pH(d)优化

2.3 MIP-QDs 的性能研究

为评价MIP-QDs 对DEHP 的特异性选择能力,以邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)为抑制剂,进行荧光响应分析,其中DEHP 质量浓度为25 mg·L-1,其他结构类似物质量浓度为50 mg·L-1,结果如图5 所示.由图可知,MIPQDs 对DEHP 有较高荧光响应,相比于BBP、DEP、DNP、DBP 等结构类似物,其Ksv值达到15.1,印迹因子(IF)达到2.37.NIP-QDs 对所有物质的荧光响应基本相同,表明构建的MIP-QDs 具有识别DEHP 的印迹位点,能够特异性识别和吸附DEHP导致荧光猝灭,而对于结构类似物,虽然具有相似的结构,但印迹位点在形状、大小以及结构上无法与之匹配,因此无法特异性识别其他物质.

图5 MIP-QDs 的选择性评估

2.4 MIP-QDs 在海水中的应用

通过分析所构建的荧光传感器在最佳体系下的线性、准确度、检出限和回收率,探讨了其在实际样品中的应用前景.如图6 所示,在最佳检测体系下,MIP-QDs 的荧光强度在0.005～25 mg·L-1的DEHP 浓度范围内随DEHP 浓度的增加而猝灭,荧光猝灭效率值(F0/F-1)逐渐增大,荧光猝灭效率与DEHP 浓度之间满足Stern-Volmer 方程,并在0.005～25 mg·L-1范围内呈良好的线性关系,满足线性方程F0/F-1=0.0152X+0.0593,相关性系数R2=0.9901,检测限(LOD)为1.5 μg·L-1,表明构建的MIP-QDs 可用于DEHP 定量测定.

图6 MIP-QDs 荧光响应线性及方程

此外,由表3 可知,在0.1、5.0、10.0 mg·L-1的3 个空白加标质量浓度下,测定的MIP-QDs 对DEHP 的回收率分别为92.0%、96.8%、95.5%,RSD均小于8.2%,表明构建的传感器可用于实际样本中DEHP 的检测.

表3 海水中DEHP 的荧光分析(n=6)

为进一步探究实际应用的可行性,采集象山港3 条入海河流的海水样本进行GC-MS/MS 和MIP-QDs 比较分析.由图7 可知,GC-MS/MS 的检测结果分别为13.22、26.64、27.44 μg·L-1,MIP-QDs的检测结果分别为11.56、23.24、25.17 μg·L-1,与GC-MS/MS 结果相比,两者RSD 小于5.5%,表明两种方法检测的结果具有较好的一致性,构建的荧光传感器可用于实际海水样本的检测.

图7 MIP-QDs 对实际样品中DEHP 的测定

3 结论

综上所述,通过改进的反相微乳液法合成了基于DEHP 的分子印迹聚合物.并成功将APTES和TEOS 接枝到量子点表面,结合量子点优异的光学特性实现了DEHP 的高灵敏度和高选择性检测.形貌和结构表征表明MIP-QDs 获得成功制备,通过优化合成和检测体系,成功构建了用于DEHP快速检测的荧光传感器.实际应用中,荧光猝灭效率(F0/F-1)与DEHP 浓度之间存在良好的线性关系,检出限低至1.5 μg·L-1.本文制备的荧光传感器进一步提高了DEHP的检测效率,在灵敏度和检测时间方面优于传统的检测方法,可应用海水中DEHP的检测.