干扰脊椎蛋白2表达抑制肺腺癌细胞增殖和转移能力的研究

李艳光，任明明，牛洁婷，唐国杰，孙震，孔繁义，宋翔

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，发病率也较高，肺癌主要有2个亚型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌是最普遍的NSCLC类型。尽管近几十年来，包括免疫疗法、放疗和手术切除治疗在内的多种治疗手段已使疗效大大提高，但肺腺癌的临床治疗效果仍然不满意，其总体5年生存率<15%[1]。目前肺腺癌的发病机制尚未完全明确，因此了解肺腺癌的发病机制并确定NSCLC患者有效疗法的潜在机制具有重要意义。脊椎蛋白2 (spondin2, SPON2 )，也称为Mindin、Dil1或M-Spondin，是一种细胞外基质蛋白，已知与整联蛋白受体结合，可调节免疫功能[2]。最近研究表明，在包括结直肠癌、肝细胞癌和胃癌等各种恶性肿瘤中，SPON2表达上调[3-5]。在结直肠癌中，SPON2可通过激活整联蛋白β1/PYK2轴来促进单核细胞的细胞骨架重塑和细胞迁移，以促进结直肠癌的恶性进展。在胃癌中Notch信号通路激活通过增加SPON2表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。SPON2具有抗肿瘤治疗分子靶点的潜力。Yuan等[6]报道SPON2在肺腺癌组织中表达上调，其高表达与肺腺癌患者不良临床病理参数相关，但是 SPON2在肺腺癌中发挥的具体作用和分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在获得SPON2作为肺腺癌治疗的潜在分子靶点提供实验室依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)研究对象：病理组织：收集2015年1月—2016年12月河北省沧州市中心医院胸外科行手术切除的肺腺癌组织及其配对的癌旁组织样本各86份，用于免疫组织化学法检测。细胞系：肺腺癌细胞系A549购自美国ATCC细胞库。(2)试药、试剂:甲苯及乙醇购自天津风船试剂公司；IHC DAKO试剂盒购自丹麦；DMEM-F12培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素和BCA蛋白浓度检测试剂盒均购自美国Thermo公司；SPON2 siRNA购自上海吉凯基因有限公司；Lip2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；CCK8试剂购自美国sigma公司；细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天试剂有限公司；PARP蛋白裂解试剂和ECL化学发光试剂盒购自北京索莱宝试剂公司；Transwell小室购自美国coring公司；PVDF膜购自美国millipore试剂公司； SPON2一抗(IHC： ab215451)、SPON2一抗(westernblotting： ab171955)和GAPDH一抗(ab171955)抗体购自英国Abcam公司。(3)仪器设备：Transwell小室购自美国coring公司；酶标仪(型号 Varioskan LUX)购自美国Thermo公司；加湿培养箱(型号 BIC-100型)购自上海儒一恒温公司；显微镜(型号 DM2700M)购自德国Leica公司；流式细胞仪(型号 FACSVia)购自美国BD公司。本实验严格遵守赫尔辛基宣言及人体临床组织的使用，经医院人体实验机构伦理委员会批准(201402104)，患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 实验方法 2021年1月—2022年4月于河北省沧州市中心医院进行实验。

1.2.1 细胞培养：采用DMEM-F12培养基培养肺腺癌细胞系A549，并添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素100 U/ml，放置在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中培养。细胞融合度为90%时，采用胰酶消化收集细胞，进行细胞传代，用于后续实验。

1.2.2 SPON2 siRNA转染细胞：处于对数期生长的肺腺癌细胞系A549消化后，以2.0×105个细胞铺至6孔板中，分为si-NC组和si-SPON2组，放置在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中培养。各组细胞贴壁更换为无血清培养基待转染，采用 lip2000转染试剂按照说明书分别将5 μg NC siRNA 转染至si-NC组，5 μg SPON2 siRNA转染至si-SPON2组。放置在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中培养，12 h后更换培养基继续培养。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 免疫组织化学法(IHC)检测SPON2蛋白表达：采用4%聚氧甲基固定待检测的肺腺癌组织及其配对的癌旁组织样本1 h，通过乙醇梯度脱水并浸润石蜡制成5 μm的石蜡切片。石蜡切片经烤片1 h后浸入二甲苯中脱蜡30 min，然后经乙醇梯度水化20 min。在枸橼酸钠抗原修复液中高温煮沸3 min，冷却后放置内源性过氧化物酶液中孵育30 min封闭非特异性抗原，PBS冲洗3次，每次3 min，后将切片在4℃下与SPON2一抗抗体(1∶100)孵育过夜，PBS冲洗3次，每次3 min，后经二抗37℃孵育30 min,然后经显色及苏木精复染后封片。2位病理学医生采用以下标准评估IHC结果：包括染色强度0分(阴性)，1分(弱阳性)，2分(中度阳性)和3分(强阳性)。染色面积：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(> 25%～50%)，3分(> 50%～75%)和4分(>75%)。将染色强度得分乘以染色面积得分来计算SPON2蛋白的最终表达评分。染色得分定义如下：得分≥3分为高表达，≤2分为低表达。

1.3.2 CCK8实验和集落形成实验检测A549细胞增殖能力：(1)CCK8实验：将si-NC组和si-SPON2组A549细胞以每孔2 000个细胞、培养基150 μl铺至96孔板中，每组设置6个平行复孔。在24、48、72 和 96 h时分别加入 CCK8溶液10 μl，放置在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中继续培养2 h。震荡混匀后采用酶标仪测量0、24、48、72、96 h时各孔细胞450 nm处的吸光度值(OD值)。(2)集落形成实验：将si-NC组和si-SPON2组A549细胞以每孔300个细胞、2 ml铺至6孔板中，每组设置3个平行复孔，放置在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中继续培养，每2 d更换1次新鲜培养基。肉眼观察到细胞克隆团后，终止培养，PBS洗3次，无水乙醇固定30 min，并用1%结晶紫染色10 min,计数细胞克隆团数目。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期分布率：收集si-NC组和si-SPON2组A549细胞，采用4℃的PBS洗涤2次后，以每管5×105个细胞收集至流式细胞管中，每组设置3个平行复孔。采用缓冲液500 μl重新悬浮细胞后，加入碘化丙啶染色液(PI)25 μl和RNase A 10 μl混匀，常温避光孵育30 min，流式细胞仪测定细胞周期分布率。

1.3.4 Transwell实验检测穿膜细胞数目：收集si-NC组和si-SPON2组A549细胞，PBS洗涤2次后，以每孔1.0×106个细胞重悬至无血清培养基100 μl中，并均匀加至Transwell小室上室的膜中，再放入含有500 μl完全培养基的Transwell小室下室中，放置在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中。培养12 h后终止培养，擦掉Transwell小室上室中未穿过膜的细胞，PBS将下室面的细胞洗3次后，放入甲醇溶液中15 min以固定细胞，结晶紫染色15 min。PBS洗3次后，显微镜下计数穿膜细胞数目。

1.3.5 Western-blot检测蛋白表达：收集si-NC组和si-SPON2组A549细胞，PBS洗涤2次后，加入PARP蛋白裂解液，充分裂解细胞。低温高速离心，吸取上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、MMP-9浓度，加入蛋白上样缓冲液煮沸使蛋白变性。采用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，采用湿转将蛋白转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。PVDF与5% 封闭液室温孵育2 h后，分别与一抗稀释液4℃孵育过夜、二抗稀释液室温孵育1 h。最终采用ECL试剂盒显示曝光蛋白条带。

2 结 果

2.1 肺腺癌组织及其癌旁组织中SPON2表达比较 IHC结果显示，肺腺癌组织中SPON2的阳性表达率为59.30%(51/86)，高于癌旁组织中的阳性表达率43.02%(37/86)，差异有统计学意义(χ2=5.821,P=0.016)，见图1。

图1 肺腺癌组织、癌旁组织中SPON2的表达比较(免疫组织化学染色，×200)

2.2 2组肺腺癌细胞SPON2表达比较 qRT-PCR结果显示，si-SPON2组细胞中SPON2的表达量为(1.00±0.03)，明显高于si-NC组的(0.41±0.02) (t=28.343,P<0.001)。

2.3 SPON2对肺腺癌细胞增殖能力的影响 CCK8实验检测结果显示，与si-NC组比较，si-SPON2组细胞增殖活性在不同时间(24、48、72、96 h)显著降低(P<0.05)，见表1；集落形成实验检测结果显示，si-SPON2组肺腺癌细胞的克隆形成数目为(50.67±8.75)个，低于si-NC组的(117.33±14.09)个，差异有统计学意义 (t=6.961,P<0.001)，见图2。

表1 si-NC组和si-SPON2组不同时点肺腺癌细胞450 nm OD值比较

图2 2组肺腺癌细胞的克隆形成数目比较

2.4 SPON2对肺腺癌细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，与si-NC组比较，si-SPON2组G0/G1期的细胞分布增加(P<0.01)，G2/M期的细胞分布增加(P<0.05)，S期的细胞分布减少(P<0.01)，见表2。

表2 si-NC组和si-SPON2组肺腺癌细胞各个细胞周期细胞比率比较

2.5 抑制SPON2对肺腺癌细胞转移能力的影响 Transwell实验检测结果显示，si-SPON2组肺腺癌细胞的穿膜数目为(20.33±4.87)个，少于si-NC组的(58.67±9.63)个，差异有统计学意义(t=6.154，P=0.002)，见图3。

图3 抑制SPON2对肺腺癌细胞转移能力的影响

2.6 抑制SPON2对肺腺癌细胞中细胞周期相关蛋白和转移相关蛋白的影响 Western-blot实验检测结果显示，与si-NC组比较，si-SPON2组肺腺癌细胞CyclinD1、CDK4、MMP-7、MMP-9表达均减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4、表3。

图4 抑制SPON2对肺腺癌细胞周期相关蛋白和转移相关蛋白表达的影响

表3 si-NC组和si-SPON2组肺腺癌细胞周期相关蛋白和转移相关蛋白表达比较

2.7 SPON2表达在肺腺癌患者不同临床病理参数间比较 在肺腺癌T分期T3～4期、N分期N1～2期、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者中SPON2表达高于T1～2期、 N0期、Ⅰ～Ⅱ期，差异具有统计学意义(P<0.05)，在不同性别、年龄患者中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 SPON2在肺腺癌组织中的表达水平与临床病理参数之间的关系 [例(%)]

2.8 SPON2表达与肺腺癌患者预后的关系 与低表达SPON2的肺腺癌患者比较，高表达SPON2的肺腺癌患者预后较差，差异有统计学意义(χ2=4.877，P=0.027)，见图5。

图5 不同SPON2表达的肺腺癌患者预后生存曲线比较

3 讨 论

SPON2通过直接与细菌和病毒病原体结合，引发先天免疫反应，是一种宿主先天免疫调节剂，是编码细胞外基质蛋白的F-Spondin超家族成员[7]。研究表明其表达异常在肿瘤进展中发挥重要作用，既往研究报道，在肾透明细胞癌和肝细胞肝癌中SPON2过表达，其中在肾透明细胞癌中SPON2表达与患者分期、组织分级和复发均显著相关[8]，在肝细胞肝癌组织中SPON2的高表达与患者肿瘤较大及患者预后较差相关[4]，可作为肾透明细胞癌和肝细胞肝癌预后生物标志物。同时Yuan等[6]研究发现，在肺腺癌中SPON2蛋白的过表达与肿瘤分化、阳性淋巴结转移、较高的血清癌胚抗原(CEA)水平和整体存活率不佳相关。本研究结果显示，SPON2在肺腺癌组织中的表达显著高于其配对的癌旁组织，SPON2在T分期、N分期、TNM分期较高及预后较差的肺腺癌组织中表达相对较高，并是肺腺癌患者预后不良的独立危险因素，与已有的报道具有一致性[6,9]，均提示SPON2可以用作监测肺腺癌预后的生物标志物，但对于某个临床病理特征的不一致，可能是由样本量及样本来源的区域不同而导致的，后续本研究会继续扩大样本量进行验证。

SPON2具有驱动肺腺癌发生发展的生物学功能，而不仅仅是显示患者预后不良的生物标志物。查阅文献显示，SPON2在结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤中促进肿瘤的进展，其中在胃癌中SPON2与Cyclin D1的启动子区结合，促进其转录水平增加，促进胃癌细胞的增殖[3，9]。结合Yuan等[6]的研究及本研究结果，SPON2在T分期和TNM分期晚期的肺腺癌患者中表达升高，提示SPON2可能促进肺腺癌细胞的增殖。本研究CCK8实验和集落形成实验结果均显示，抑制SPON2的表达可抑制肺腺癌细胞的增殖能力。在正常生理过程中，细胞周期具有严密的调控机制，当细胞周期调控失调时，细胞增殖能力增加，是肿瘤发生发展的重要机制之一[10-12]。本研究结果显示，抑制SPON2的表达后，肺腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期，表明SPON2促进肺腺癌的周期进展进而促进细胞增殖。细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4是调控G0/G1期转换的关键蛋白，CDK4与Cyclin D1结合形成复合物，并表现出激酶活性，促进下游蛋白磷酸化，驱动细胞周期进展[13-15]。本研究抑制SPON2的表达后，肺腺癌细胞中Cyclin D1和CDK4蛋白表达降低，表明SPON2通过增加Cyclin D1和CDK4 蛋白的表达促进细胞周期的进展，导致细胞增殖能力增加。与徐正磊等[9]报道的SPON2促进胃癌细胞中Cyclin D1的表达一致，但是本研究未对SPON2和cyclinD1直接结合进行相关研究。

研究发现，SPON2对于募集淋巴细胞和引发免疫反应至关重要，尤其是在肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)浸润中。TAM是肿瘤与免疫微环境之间复杂相互作用的关键调节剂，包括肿瘤的迁移调控[16]，提示SPON2与肿瘤迁移相关。新近研究表明，SPON2在细胞迁移和肿瘤进展中具有复杂的作用，在肝细胞癌(HCC)的肿瘤微环境中，SPON2-α4β1整合素信号传导激活增加F-肌动蛋白的重组并促进M1样表型巨噬细胞的浸润，而SPON2-α5β1整合素信号传导失活并防止F-肌动蛋白组装，抑制HCC细胞迁移能力，研究结果表明，在肝细胞癌中SPON2充当抑癌因子，并利用不同的信号通路在肝细胞肝癌的微环境中执行双重功能[4]。但是在结直肠癌中SPON2通过促进M2样表型巨噬细胞的浸润，以促进肿瘤细胞的转移。此外SPON2可促进胃癌和肾透明细胞癌的侵袭转移能力[3]。而在本研究中干扰SPON2的表达，肺腺癌细胞的转移能力显著降低，与在结直肠癌和胃癌中的报道一致，也与肺腺癌N分期较高的患者癌组织中SPON2表达较高一致。细胞外基质的降解是细胞入侵和转移开始的信号，基质金属蛋白酶(MMP)是参与细胞外基质降解和转移的重要分子[17]，在胃癌组织中SPON2与MMP-9表达呈正比[18]，本研究结果显示抑制SPON2的表达，肺腺癌细胞中MMP-7、MMP-9蛋白表达降低，提示SPON2通过调控基质金属蛋白酶MMP-7、MMP-9蛋白促进肺腺癌细胞转移能力。

综上所述，SPON2在肺腺癌组织中表达升高，与肺腺癌患者不良病理参数和预后相关，SPON2通过调控细胞周期相关蛋白和基质金属蛋白酶促进肺腺癌细胞增殖和转移能力。SPON2具有作为肺腺癌患者预后不良生物标志物和分子靶点的重要意义。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李艳光：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写;任明明：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;牛洁婷：进行统计学分析;唐国杰：课题设计，论文审核；孙震：实施研究过程，分析试验数据；孔繁义:资料搜集整理，论文修改；宋翔：提出研究思路，分析试验数据