一种美白产品SammiWhite的抗氧化活性研究

曲艳波，张佳琪，裴 潇，吴慧敏，张万举

(黄冈师范学院化学化工学院，湖北 黄冈 438000)

随着社会的发展和人民生活水平的提高，越来越多的人在享受美好生活的同时有了延缓衰老的需求，市场上随之出现了各类保健产品，这些产品的实际应用效果和安全性是消费者关心的重要问题，其中由纯天然成分制成的保健产品尤为引入关注。自由基学说又称自由基衰老理论，最早有美国科学家纳姆·哈曼(Denham Harman)在1956年提出并发布。他认为自由基是破坏生物大分子、导致细胞衰老和机体衰老的主要原因，衰老过程中的退行性变化，如组织细胞发生的变性、坏死等是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基造成的。自由基学说能够合理解释机体衰老过程中出现的种种症状(老年斑、皱纹、免疫力下降等)，目前已被医学界普遍接受，即衰老是来自机体遭受自由基侵害而发生的破坏性结果。基于该理论，目前市场上出现了各类保健品，其主要原理均为通过清除自由基达到延缓衰老、美白皮肤等效果。

SammiWhite美肌丸白番茄胶囊中含有CaroWhite、Multi-AOx、橄榄油提取物和L-半胱氨酸等活性成分。其中CaroWhite的主要成分是两种天然无色类胡萝卜素(CLC)八氢番茄红素和六氢番茄红素，具有很强的抗氧化活性，清除自由基的功效远胜于维生素E和其他类胡萝卜素[1]。橄榄油提取物中卟啉化学结构能形成 “分子络合物”还原游离自由基而具有抗氧化活性[2]，是最有效的天然抗氧化剂之一。白番茄是来自以色列的特有品种，其中含有丰富的天然无色类胡萝卜素(CLC)，对大多数动物与人类胡萝卜素是经食物链传递、积累、代谢，呈现复杂多样的结构，在机体内具有清除自由基，抗氧化，生成维生素A，调控细胞信号通路上调抗氧化酶等特性以预防疾病促进健康[3]，抗氧化能力是普通番茄的几百倍，SammiWhite中白番茄占22%。

目前，已经有多种方法应用于化合物抗氧化能力评价，如氧自由基吸收能力法(ORAC)、次氯酸盐自由基法、ABTS法、DPPH法等。抗氧化评价方法各有千秋，但相比较而言，DPPH法简单易行，是常用的方法之一。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，广泛应用于定量测定生物试样、纯化合物、提取物的体外抗氧化能力。本文选取SammiWhite美肌丸白番茄胶囊为研究对象，采用超声辅助提取其抗氧化成分，并采用DPPH法对其抗氧化活性进行了研究，为纯天然成分制备延缓衰老的保健产品提供一定的基础。

1 实验材料及仪器

主要仪器：TU1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；RE2000A旋转蒸发仪，上海力辰仪器科技有限公司；H2500R高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DS-5510DTH，上海生析超声仪器有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；ME104E电子分析天平，梅特勒托利多集团。

主要试剂：DPPH(AR)，国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸Vc(AR)，国药集团化学试剂有限公司；甲醇(AR)，武汉欣申试化工科技有限公司；乙醇(AR)，国药集团化学试剂有限公司。

2 实验方法

2.1 SammiWhite抗氧化成分的提取

取市售SammiWhite硬胶囊20粒，去胶囊皮收集内容物，用研钵碾细，然后称取样品3.5 g置于250 mL烧杯中，加入一定量的甲醇充分混匀，料液比例为1:30(g/mL)。将溶液加热至55 ℃超声提取15 min，连续提取三次，合并离心液，采用离心机离心5 min得上清液(5000 r/min)，合并上清液并采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，最后将浓缩后得到的固体提取物真空干燥12 h，得到SammiWhite胶囊提取物(标记为SW)。

2.2 DPPH法抗氧化活性研究

DPPH法是研究化合物体外抗氧化活性的经典方法之一，具有操作简洁、计量准确等优点，目前被广泛采用。此法主要依据DPPH自由基有单电子，在紫外517 nm处有最大吸收，且其醇溶液呈紫色的特性[4]。自由基清除剂可以捕获DPPH中的单电子而使其颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度变小，且其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除能力越强，吸光度越小[5-6]。被测化合物的抗氧化活性通常用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化活性越强。

2.2.1 标准曲线的绘制

准确称取DPPH 0.0022 g于100 mL容量瓶中，无水甲醇定容得储备液，浓度为0.022 mg/mL。分别用移液枪取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL储备液，置于10 mL具塞试管中，用甲醇定容至10 mL，配成浓度分别为0.0022 mg/mL、0.0044 mg/mL、0.0066 mg/mL、0.0088 mg/mL、0.0110 mg/mL的DPPH标准溶液，测定上述各浓度标准溶液在517 nm波长处的吸光度，绘制标准曲线，并拟合回归方程。

DPPH残留率[7]的计算公式为：REM=c/c0×100%。式中:c为加入抗氧化剂稳定后DPPH的质量浓度;c0为DPPH的原始质量浓度。

2.2.2 抗氧化活性测定

根据残留率公式计算出DPPH残留率，设为纵坐标，相对应的样品添加量设为横坐标。绘制出不同浓度梯度样品清除DPPH的残留率曲线，并添加回归方程式。根据回归方程式，计算出当DPPH残留率为50%时，抗氧化剂样品添加量的大小，即半数清除浓度(IC50)[8-9]。

(1)配置DPPH溶液：准确称取DPPH 2.2 mg，用无水甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，制得浓度为0.022 mg/mL的DPPH溶液，避光保存，备用。

(2)配置样品溶液：精密称取SW 500 mg，用无水甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为5 mg/mL的供试品母液。用移液管在容量瓶中分别吸取1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL母液，并分别将其稀释成浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL共五种不同系列的供试品溶液。

(3)配置抗坏血酸溶液：按上述步骤来配制浓度分别为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL的抗坏血酸溶液，作为阳性对照。

(4)SW清除DPPH自由基实验：分别量取不同浓度的供试品溶液0.1 mL加入10 mL具塞试管中，加入配置好的DPPH溶液3.9 mL，避光反应30 min，以无水甲醇为空白对照，测定其在517 nm处的吸光度，每种样品液作三次平行，取平均值。

(5)对照实验：重复上一步，分别量取不同浓度的抗坏血酸溶液进行实验，测定其在517 nm处的吸光度，每种样品液作三次平行，取平均值。

(6)清除自由基半数有效量的计算和自由基清除能力的评价：根据化合物清除DPPH自由基的曲线，计算得到DPPH自由基原始质量浓度减少至50%时化合物的用量为半数有效量(IC50)。自由基清除能力AE=1/IC50，根据AE的大小判断抗氧化剂清除自由基的能力的大小。

3 结果与讨论

3.1 DPPH标准曲线的绘制

分光光度法测定不同浓度的DPPH标准溶液在517 nm处的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标做图，绘制DPPH标准曲线图1所示。做线性回归分析，得到其线性回归方程为：y=36.2727x-0.0660 (R=0.9996)，表明DPPH自由基浓度与其吸光度呈明显正相关关系。

图1 DPPH自由基的标准曲线

3.2 抗氧化活性分析

DPPH溶液中加入不同浓度的SW溶液和Vc溶液，避光反应30 min后，在波长517 nm处测其吸光度，根据DPPH残留率计算公式计算DPPH自由基的残留率，结果见表1。以DPPH自由基残留率为纵坐标，SW及Vc溶液的浓度为横坐标，绘制残留率浓度关系曲线(图2)。根据线性分析，SW清除 DPPH自由基的残余率的回归方程为y=-56.2073x+16.6967(R=0.9997)，而Vc清除 DPPH自由基的残余率的回归方程为y=-63.104x+20.348(R2=0.9996)。比较两种物质对DPPH自由基的清除能力可知，SW和Vc均对DPPH自由基有较好的清除效果，且清除率与其浓度呈正相关。根据方程计算可得SW清除DPPH自由基的IC50为0.288 mg/mL，AE值为3.472，而对照品Vc清除DPPH自由基的IC50为0.338 mg/mL，AE值分别为2.959。比较实验结果可知，SW清除DPPH自由基能力高于对照品Vc，表现出较强的DPPH自由基清除能力。

图2 DPPH的残留率曲线

表1 DPPH与SM/Vc相互作用后的残留率

DPPH法是判定化合物体外抗氧化活性的经典实验方法。本研究结果表明SammiWhite胶囊提取物(SW)随着剂量的增加，DPPH自由基清除率相应增加，该剂量依赖关系提示SW能够与DPPH自由基结合生成DPPH-SW，从而消耗DPPH，降低DPPH自由基含量，达到清除自由基的功效[10]。SW能够清除DPPH自由基，具有抗氧化活性，可以在此基础上进一步进行更深入的研究，以达到开发相关产品的目的。

4 结 论

本实验采用超声提取法从美白产品SammiWhite中得到提取物(SW)，通过DPPH法研究了SW的抗氧化活性。实验结果表明，SW具有较强的DPPH自由基清除能力，并表现出明显的剂量依赖关系，SW对DPPH自由基的半数清除浓度IC50值为0.288 mg/mL，AE值为3.472，优于对照品Vc。保健产品的有效性和安全性越来越受关注，本研究能够为相关产品的开发提供一定的参考信息。