兔病毒性出血症疫苗及免疫预防

文│吴宣（四川省动物疫病预防控制中心）

兔病毒性出血症又称兔瘟，是由兔出血症病毒（RHDV）引起的兔的一种急性高度接触性传染病，以呼吸系统出血、实质性器官出血水肿变化为特征，该病传播快、发病急、潜伏期短，感染后2～3天迅速死亡，死亡率极高（90%～100%）。当前国内预防兔病毒性出血症常用的灭活疫苗有：兔瘟单苗、兔-巴二联苗、兔-巴-魏（波）三联苗。随着分子生物学的发展，基因工程苗的研究也有了很大的进展。

一、组织灭活疫苗

组织灭活疫苗制备原理是兔病毒性出血症病毒加入0.5%甲醛溶液制成的悬液在37℃下失去致病性而保持其免疫原性。制备过程是将兔瘟病毒接种健康兔，收取24～72小时死亡兔的含毒组织（肝、脾、肾），用缓冲液捣碎过滤后，经0.5%甲醛溶液37℃灭活24小时而制成。用该苗接种后，兔6～10天产生抗兔病毒性出血症病毒的抗体，12～16天抗体效价达到峰值，随后开始下降。在疫苗生产中，免疫佐剂起着重要的作用，加了佐剂的组织灭活苗克服了抗体峰值和抗体持续时间短的问题。随着动物免疫佐剂的研究，出现了多种免疫佐剂，比如黄芪多糖、铝胶、蜂胶、弗氏佐剂等，加入佐剂的灭活疫苗可以提高兔病毒性出血症病毒抗原的免疫原性，刺激机体迅速产生抗体，并促使免疫系统内相关免疫细胞的活化，使抗体效价维持天数增长。经过研究发现，黄芪多糖作为中药，具有消炎、杀菌、增强免疫力的作用，加入黄芪多糖佐剂的疫苗，抗体效价维持最长。

组织灭活疫苗在生产上一直具有良好的免疫效果，在规模场中被广泛使用。一般在30～35日龄首免，60～65日龄二免，后备兔及母兔每隔3～5个月加强免疫，春秋发病高峰还要补充免疫。规模场对兔群不断地加强免疫增加了养殖成本，加上易感兔和非免疫兔的日益减少，疫苗生产成本和养殖户的养殖成本不断增加。加上生产不稳定，制作工艺烦琐，生产过程中散毒风险的存在，兔群机体还有一定的组织过敏反应。这些因素都导致灭活苗的发展受到限制，目前学者们主要着眼于RHDV疫苗基因工程疫苗的研究。

二、瘟巴二联苗

将兔瘟强毒株接种健康兔，采取含毒组织（肝、脾、肾），捣碎过滤灭活后，制成灭活液。将标准兔多杀性巴氏杆菌菌株纯化后在马丁肉汤中含氧培养，纯检后备用。然后按照比例加上氢氧化铝胶、蜂胶等佐剂配制成二联苗。制备过程中优化生产工艺、提纯病毒、提高抗原含量，两种抗原之间无互相干扰，产生的两种抗体滴度均达到最高。该疫苗产生抗体快，5～7天产生坚强的免疫效果；免疫期长，免疫期达6个月；兔瘟保护率95%，巴氏杆菌病保护率80%；12℃保存有效期达10月以上。

三、 兔瘟-巴氏杆菌病-魏氏梭菌三联灭活疫苗

将兔瘟病毒皮下接种健康兔，采取濒死或者死亡兔的肝、脾、肾等含毒组织，将组织捣碎后按比例加盐水研磨过滤，加入甲醛混匀灭活。将巴氏杆菌接种含有裂解血的马丁肉汤中培养24小时，纯净性检合格后再将菌种接种于血液马丁肉汤中含氧培养，菌液涂片检查纯度合格后按一定含菌量加入甲醛灭活。将魏氏梭菌接种到肉肝胃酶消化汤中，纯检合格后再接种到新的肉肝胃酶消化汤中培养。将合格菌液加入甲醛溶液灭活。将三种合格的灭活毒（菌）液调pH值到7.0，然后按照比例加上氢氧化铝胶、蜂胶等佐剂配制成兔瘟-巴氏杆菌病-魏氏梭菌三联灭活疫苗，经无菌、安全、效力实验和物理性状检验合格后备用。

二联苗、三联苗的对兔瘟的防治有重要作用，效果明显、易保存，运输方便，可在生产上也出现过注射联苗后在免疫期内仍发生兔瘟流行，而且也存在灭活不完全引起的风险，加上如何平衡兔瘟和巴氏杆菌病、魏氏梭菌病的免疫期差距和配制比例，以增强免疫力、延长免疫期、降低成本也是值得进一步研究的问题。市场上很多联苗因为各抗原比例、浓度等问题，在生产上使用的剂量很大，副作用很明显，免疫效果也受到影响。

四、 基因工程疫苗

1.基因工程亚单位疫苗。VP60是RHDV的主要结构蛋白，有两个主要的抗原决定簇，具有很高的抗原免疫性，是诱导抗病毒感染的主要核衣壳蛋白，也是分析病毒属性和亲缘关系的蛋白。通过基因工程技术将RHDV的VP60蛋白在表达载体（昆虫细胞或者幼虫、大肠杆菌、乳酸杆菌、腺病毒、酵母、转基因马铃薯）中进行体外表达，所表达的蛋白自我装配成与RHDV大小和形态相似的病毒样颗粒（VLPs），该病毒颗粒不含病毒核酸，无法复制和扩增，无感染性，但具有免疫原性，可激活固有免疫应答。Boga J A等就VP60在大肠杆菌中表达，表达蛋白加入弗氏佐剂免疫兔群，能够对兔产生保护作用。王永山等将VP60基因在大肠杆菌中表达，用重组蛋白、免疫佐剂和卡介苗素制备的亚单位疫苗，该疫苗能保护兔抵抗2倍常规攻毒剂量强毒的攻击。Nagesha H S等用杆状病毒-昆虫细胞系统表达了VP60，表达蛋白可装配成类病毒样粒子（VLPs），病毒样粒子可刺激兔群机体产生强烈的体液免疫，抵抗RHDV的攻击。Xuexing Zheng等用重组杆状病毒在蚕的幼虫中表达VP60蛋白，加入弗氏佐剂乳化后，免疫兔群，免疫保护期可达一年；没有加佐剂的保护期仅有180天。Boga J A等将VP60的编码序列插入酵母表达，重组的VP60蛋白抗原在不加佐剂条件下可对RHDV完全保护。严维魏等将VP60基因插入酵母转移载体中获得重组酵母菌，该酵母菌具有良好的抗原性，且血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。李传山等构建了植物表达载体pBI21-VP60，利用根瘤农杆菌介导叶盘法转化串叶松香草筛选拟转基因植株，生产RHDV食用疫苗。Castanon S等构建了植物表达载体PK2-VP60表达蛋白，加入弗氏佐剂皮下注射成年兔，对照兔40小时后死亡，有明显的临床症状，而免疫兔全部存活。

VLPs具有较好的免疫原性和更好的安全性，易被免疫系统识别。用VLPs制备的疫苗低剂量免疫后就能刺激机体产生良好的免疫应答，免疫兔后即可产生较强的体液免疫应答，保护性抗体可维持1年以上。VLPs作为VP60的亚单位表达蛋白，具有很高的免疫原性，且稳定性好、安全性高，疫苗产量不受免疫兔数量的限制，可大规模生产。江苏省农业科学院兔病学科团队研发的兔病毒性出血症杆状病毒载体灭活疫苗（BACVP60株）获得国家新兽药一类注册证书，这是我国第一个兔用基因工程疫苗，也是世界上第一个获得政府许可证的兔瘟亚单位疫苗。该疫苗对家兔保护率为100%，免疫有效期达7个月，保存期长达24个月。

2.重组病毒活载体疫苗。随着分子生物学的研究进展，VP60蛋白可在大肠杆菌、酵母和昆虫细胞等表达系统表达，制备成亚单位疫苗，也可用马铃薯病毒（PPV）、串叶松香草、百脉根等植物表达为载体的重组PPV-NK-VP60蛋白，利用植物进行口服免疫，对预防RHDV是一个全新的思路。Bertagnoli S等用牛痘病毒为载体构建的重组病毒经皮内和口服免疫兔，可抵抗RHDV强毒的攻击，对野兔的RHD也有很好的免疫作用。Erlinda Fernundeza等用腺病毒载体构建了表达VP60蛋白的重组载体制备疫苗，产生的抗体可保持1年以上。此外还有很多学者用鸟痘病毒、兔痘病毒、金丝雀痘病毒等为基础的载体构建的重组病毒活载体疫苗，可产生滴度很高的抗RHDV特异性抗体，抵抗RHDV强毒的攻击。重组疫苗对妊娠母兔和其繁殖率无任何的副作用，具有良好的生物安全性和稳定性。Torres等用100倍的试验剂量对重组病毒疫苗使用的安全性做了评估，未引起家兔的免疫耐受，对孕兔也未造成伤害。

Barcena J等用减毒的黏液瘤病毒（MV）构建表达出的VP60免疫兔，可同时保护MV和RHDV和攻击，因为表达的重组病毒带有可转移的胃肠炎病毒（TGEV）的抗原决定簇。Juan Barcena等用MV的一株自然弱毒株构建了重组RHDV活载体疫苗，也可阻止两种疾病的发生。Bertagnoli S等用MV的一株细胞致弱毒株构建了重组MV-RHDV，可诱导高水平的RHDV和MV特异性抗体，可抵抗致死量RHDV和MV的攻击。用兔黏液瘤病毒作为RHDV的载体，可同时有效预防兔群的两大疾病，有效地降低了重组疫苗向非目标宿主散播的风险。致弱的兔黏液瘤病毒，既不会向自然界引入新病毒的危险，也可保证病毒的水平传播特性。黄艳秋等用牛疱疹病毒1型为载体，制备了RHDV VP60重组蛋白疫苗，该疫苗可诱导小鼠产生RHDV特异性抗体。

兔病毒性出血症基因工程疫苗的研制及在临床中的成功应用，为我国养兔业在兔瘟防控领域找到新的方向，但是不同载体表达产物作为基因工程疫苗仍具有不同的缺陷。比如大肠杆菌表达的VP60具有不可溶性及免疫效果相对较差；重组痘病毒载体疫苗引起兔全身潜伏感染；重组病毒疫苗存在向环境扩散的安全问题；转基因植物载体的表达量不理想等，加上新的变异亚型的出现，传统的兔病毒性出血症疫苗无法对其保护。但是Nadya Urakova（30）等研究发现RHDV在小鼠体内的能力较差，用高剂量的RHDV攻击标准的实验室小鼠和缺乏功能性I型干扰素受体的基因敲除动物，这些动物都没有出现疾病的临床迹象，通过实时聚合酶链式反应PCR对病毒RNA的时间定量也并没有显示出病毒扩增的迹象。这些数据表明RHDV不能在小鼠体内复制，甚至不能在先天免疫系统严重受损的动物体内复制。这就需要科研人员加快对基因工程疫苗的研发，使其发挥优良高效的免疫保护作用，以保障养兔业的健康发展。