水稻组织中可培养内生细菌的分离鉴定及功能分析

黄博闻， 王 亚， 葛 静， 孙 星， 王冬兰， 余向阳

(1.江苏大学环境与安全工程学院，江苏 镇江 212013； 2.省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室/江苏省农业科学院，江苏 南京 210014)

内生细菌是指可以在植物内部组织中定殖的，不会造成任何直接的、明显的负面影响的细菌[1-2]。内生细菌广泛分布于植物的各个组织中，如根、茎、叶、种子等的细胞或细胞间隙[3]，甚至在植物的根瘤中也存在[4]。

内生菌参与调控水稻众多生理活动[5]。利用内生菌促进植物生长、增强作物抗病能力、减轻污染胁迫是实现水稻优质高产的有效方法[6]。Feng等[7]发现施用含促生与有机污染物降解功能的内生菌可显著提高水稻生物量，同时减少水稻对有机污染物的富集。研究结果表明，植物内生菌可通过分泌次生代谢物诱导水稻自身抗性的形成[8]或直接应对病原体[9]。Haruna等[10]发现Sphingomonasmelonis通过产生邻氨基苯甲酸干扰水稻种子病原菌Burkholderiaplantarii的σ因子RpoS，从而抑制毒力因子合成。此外，一些有益内生菌还可以通过水稻种子跨代传播[11]，它们在促进植物种子萌发、根毛形成、诱导水稻幼苗抗病性等方面发挥重要作用[12]。

水稻内生细菌群落分布与组成受环境因子[13]、水稻品种与生长期[14]等因素影响。研究结果表明，分蘖期的水稻内生菌多样性丰富，分布均匀[14]。因此，研究不同地区不同品种水稻分蘖期的内生菌分布，有助于了解水稻与内生菌互作关系，有利于更好地将内生菌应用于农业，实现减少化肥施用、减少农药施用、修复土壤环境等目标[15]，推动农业的绿色可持续发展。目前，有关江苏省主要水稻品种中内生菌群落分布的研究尚无报道，对不同品种水稻内生菌菌种库的构建也鲜有报道。本研究对江苏33个水稻品种分蘖期的根和茎叶中的内生菌进行分离、鉴定和分析，初步构建了不同品种水稻内生菌菌种资源库，为挖掘水稻微生物资源，促进水稻育种发展提供了资源和依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试验药品：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)与琼脂(青岛海博生物技术有限公司产品)，次氯酸钠(AR，天茂化工有限公司产品)；95%乙醇(南京寿德生物有限公司产品)。

仪器：上海知楚ZQZY-90F振荡培养箱，Eppendorf Centrifuge 5804R高速离心机，苏净SW-CJ-1D超净工作台。

1.2 试验材料

分蘖期水稻植株采自江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田，所采集样品来自同一片区域，样品取回后储存于4 ℃冰箱中，于2 d内完成样品处理。

水稻品种：丰粳3227、沪软1212、华粳5、华粳8号、淮粳5号、金粳818、金香玉2号、连粳11、连粳15、南粳45、南粳46、南粳47、南粳49、南粳5055、南粳9108、宁粳8号、日本晴、苏沪香粳、苏香粳100、苏香粳2号、苏秀867、皖垦粳11036、武育粳3号、武育粳80号、武运粳27号、武运粳29号、徐稻3、盐粳16、扬粳3012、扬粳3491、扬粳4227、扬育粳2号、镇稻18号、镇稻99。

1.3 样品收集与表面消毒

将采集的水稻植株用蒸馏水洗净，每个品种随机取3～5株。用剪刀将水稻分为根与茎叶两部分并立即进行表面消毒，方法参照文献[5]：采用75%酒精浸没样品2 min，采用3%次氯酸钠浸没2 min，每次弃去溶液后用无菌水润洗3次。最后1次灭菌水涂布于LB固体平板，验证灭菌效果。向装有经过消毒的水稻组织样品的离心管中加入2颗灭菌磁珠，然后使用往复式震荡机在750 r/min频率下研磨20 min获得组织匀浆液。

1.4 菌种分离纯化与保存

取0.5 ml匀浆液用无菌水进行4倍稀释，并移取100 μl 稀释液涂布于TSB固体平板，每个品种3次重复，并置于30 ℃恒温培养箱。挑选平板中的单菌落进行平板划线直至获得纯化菌种。

20%甘油菌液制备：吸取0.5 ml 纯化菌种菌液与40%甘油冻存于-80 ℃冰箱。

1.5 菌种鉴定与数据处理

正向引物25F:5′-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；反向引物1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR反应条件参照文献[16]。扩增产物送南京通用生物公司测序，所得序列拼接后在GenBank数据库中进行比对，将菌株序列相似度>98%的归为同一种。

采用Origin pro绘图，采用Excel统计数据；不同品种水稻的抗病能力及亲本信息参考https://www.ricedata.cn/。

2 结果与分析

2.1 可培养内生细菌

经测序鉴定后，从33个水稻品种中共获得119株可培养内生细菌，其中根中分离出的内生细菌77株，茎叶中分离出的内生细菌39株，3株未定义，共涉及19个属，从分类水平看，根部分离出的内生菌数量明显高于茎叶部(P<0.05)。

2.2 不同品种水稻优势内生菌

为探究不同品种中优势内生菌，对分离出的119株内生菌进行属水平分类，共可分为18个菌属：不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、 节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、贪铜菌属(Cupriavidus)、纤维菌属(Cellulosimicrobium)、肠杆菌属(Enterobacter)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、假芽孢杆菌属(Fictibacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)、地杆菌属(Terrabacter)。其中，Bacillus、Aeromonas和Exiguobacterium在水稻组织中出现频次最高，分别占26%、19%和16%。属水平统计结果显示，芽孢杆菌属在水稻内生菌属中占比最高。对该属中32株细菌进行菌种分析发现，巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌是主要菌种，分别占总芽孢杆菌菌群的19%、13%和6%。

2.3 水稻不同器官优势内生菌属

对各品种水稻组织中分离出的菌属进行统计，从水稻根部分离得到16种菌属，其中优势菌属(占比>10%)依次为Bacillus(31%)、Aeromonas(17%)和Exiguobacterium(15%)；从水稻茎叶部分离得到10种菌属，优势菌属依次为Aeromonas(28%)、Bacillus(20%)、Exiguobacterium(18%)和Microbacterium(13%)。其中，根与茎叶中共有菌属6种，分别为Bacillus、Aeromonas、Exiguobacterium、Microbacterium、Arthrobacter和Enterobacter。

2.4 亲本水稻品种内生菌与后代水稻品种内生菌的关系

33个品种中有8个品种存在亲缘关系，分析发现，亲本水稻品种(镇稻99、徐稻3号、南粳46、武育粳3号)与各自的杂交后代水稻品种(扬粳3491、扬育粳2号、沪软1212、淮粳5号)至少存在1种或2种共有内生菌。其中，在母本镇稻99与后代品种扬粳3491之间发现共有内生菌Microbacteriumlaevaniformansstrain；在父本徐稻3号与后代品种扬育粳2号间发现共有内生菌Microbacteriumlaevaniformansstrain，在父本南粳46与后代品种沪软1212间发现共有内生菌Bacilluscereusstrain，在母本武育粳3号与后代品种淮粳5号间发现共有内生菌Exiguobacteriumsp.和Bacillussp.。

2.5 不同品种水稻中抗病菌属分布

水稻中已被广泛报道的具有抗病能力的内生细菌属主要为Bacillus、Lysinibacillus和Pseudomonas。苏沪香粳中分离出了最多数量的Bacillus内生菌，这可能在一定程度上与其优良的抗叶枯病和抗稻瘟病的特性相关。其他17个品种中都分离出1～2种可能与抗病相关的菌属，Bacillus在18个品种中分布相比其他抗病菌属更广。

3 讨 论

3.1 33个水稻品种中内生菌组成的多样性

研究结果显示，33个水稻品种中的内生菌共涉及4个菌门：变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。其中，2种核心菌门(厚壁菌门与变形菌门)在各品种中共存。这与相关研究结果[17-18]一致，符合水稻组织中常见菌群组成规律。本研究中，多个品种中厚壁菌门占比高于变形菌门。厚壁菌门被认为具有降解大分子有机物(如蛋白质、脂质、纤维素等)的功能[19]，这与水稻样品收集区域大规模施用有机肥有密切关系，厚壁菌门的升高有助于土壤中有机质的分解利用[20]。变形菌门主要参与固氮，较高的丰度有助于水稻土壤肥力的保持[21]。

从属水平看，本研究发现同一区域内不同品种中优势内生细菌具有相似性。在长期的自然选择中，具有优异功能的内生菌更容易被不同品种选择[22]，这些内生菌通过增加植物的养分摄入量及影响植物激素的释放[23]，在与植物的互作中占据有利生态位，从而避免在根际土与叶际等外部环境与其他微生物竞争[24]。其中，Bacillus、Aeromonas和Exiguobacterium作为常见优势菌群在南京33个水稻品种中广泛分布，这与菌属自身具有的有益功能密不可分。Bacillus被广泛报导具有抗逆、促生以及良好的生防功能[25-26]。从分布看，芽孢杆菌在水稻根内分布更广，这与相关报导[27]一致。本研究结果表明，分离出的芽孢杆菌菌种主要包括枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌具有生防特性[26]，能够降解塑化剂等有机污染物[28]；蜡状芽孢杆菌兼具解钾促生功能[29]，可促进水稻营养代谢；巨大芽孢杆同时具备溶磷功能[30]，后两者可能是水稻根部营养吸收的重要菌群，而前者为水稻抗病提供了保障。Exiguobacterium被认为具有耐受寒冷与盐碱[31]等极端环境的特性，拥有还原铬、砷等具有毒性的重金属离子的能力[32]，具有降解农药、苯及其同系物等有机化合物的活性。Exiguobacterium的协同作用会使Bacillus反硝化能力显著提高。Aeromonas是常见的耐盐菌属[33]，具有反硝化和除磷功能[34]，从分布看，Aeromonas倾向于定殖于水稻叶内，在多种水稻品种中占比达28%。总之，3种菌属对水稻生长发挥了巨大作用，且菌属之间存在协同效应，是水稻生产中最有应用潜力的菌属。

3.2 亲本水稻品种内生菌与杂交后代水稻品种内生菌的关联

植物利用种子作为载体，通过垂直传播保留部分具有重要生态学功能的内生菌，使后代继承由内生菌赋予的优势[35]。本研究发现，后代水稻品种中分离出的内生菌可以追溯到1个亲本中的1种或2种，这与相关研究结果[36]一致。Liu等[37]研究了分蘖期超级杂交稻与其亲本间内生菌群落组成发现，3种水稻内生菌群落组成与结构虽然存在差异，但后代水稻品种中优势菌属与亲本保持一致。Hardoim等[38]研究发现，在第二代种子中发现了来自第一代水稻种子中45%的细菌群落。垂直传播的种子内生菌对作物抗性组成、环境适应性与生长具有重大影响[39]。本研究中Microbacteriumlaevaniformansstrain的垂直传播在水稻品种中多次被发现，它具有耐金属、耐硝酸盐和适应低pH值的特性，有助于后代水稻品种更快地适应当地环境。Liu等[40]发现，来自种子中的内生菌可随水稻生长定殖于植物根部并通过分泌次生代谢物提高水稻对镉污染的抗性。禾本科的一些垂直传播真菌内生菌可以赋予宿主特殊生物碱阻止食草动物的采食或增加营养成分[41-42]。已有研究结果表明，内生菌通过垂直传播的方式从亲本植物传递到后代会使后代具有比水平传播模式更高的环境适应潜力，因为在水平传播模式下，植物需要从环境中重新招募相关微生物[39]。后代水稻品种可从种子中获得来自亲本的优势菌属，也可从土壤中再次选择性招募相似菌属[11]。相关研究结果表明，即使在不同地点重新培养后，许多相似的内生菌群仍然存在于后代水稻品种中[36]。这表明，在长期的协同进化中，来自亲本的生物信息或资源可能有助于内生菌在其后代中的形成[39]，促使后代水稻品种从土壤中招募相似的有益内生菌。

尽管水稻内生细菌组成受到基因型、发育阶段等诸多因素影响，但是同一区域内不同品种水稻中仍然存在一些核心内生菌， 本试验33个水稻品种中常见核心内生菌群为Aeromonas、Exiguobacterium、Bacillus和Microbacterium。至于这些内生菌如何与水稻互作发挥功能仍有待进一步研究。本研究结果丰富了水稻内生菌菌种库。