投喂频率对杂交鲷及黑鲷的体成分、血清生化及基因表达的影响

孙瑞健 ，仇玉燕 ，2，杨志强 ，倪可雯 ，2，徐大凤 ，于雯雯 ，刘艳丽 ，肖李霞 ，陈淑吟 *

（1.江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007；2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；3.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；4.启东市渔业技术推广站，江苏 启东 226213）

适宜的投喂频率不仅可以促进鱼的健康生长，降低规格差异，还可以节约饲料，改善水质[1-3]。通过检测鱼体健康相关指标，可以了解设置的投喂频率是否适宜。文献[4]研究表明，鱼体的营养状况、健康水平以及生理代谢等情况，可以通过体成分与血清生化指标来反映；文献[5-6]指出，投喂频率对鱼类的体成分和血清生化指标等有显著影响。如投喂次数从每日1 次增加至4 次，条石鲷（Oplegnathus fasciatus）幼鱼的粗脂肪含量显著升高8.8%，而灰分含量显著降低11.8%[7]；牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼鱼每天投喂3 次较每2 d投喂1 次的粗蛋白和粗脂肪含量分别升高10.6%和 87.5%[8]；花鲈（Lateolabrax maculatus）幼鱼的水分含量随着投喂次数的升高而降低[9]。团头鲂（Megalobrama amblycephala） 在每日投喂 3~4 次时，血液溶菌酶含量升高[10]；饥饿状态会导致黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）幼鱼血清总蛋白含量显著升高[11]。另外，与鱼体营养及能量需求相关功能基因也受到投喂频率的影响[12]。当投喂频率从每日2 次升至4 次时，中华鲟（Acipenser sinensis）幼鱼肝脏ghr 基因表达量显著降低，igf1 表达量显著升高[13]；每日投喂 4 次，黄颡鱼（P. fulvidraco）幼鱼的肝脏lpl[14]及sod[15]基因表达量均显著高于只投喂1 次的。

杂交鲷为选育的新品系，是以黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）（♀）×真鲷（Pagrus major）（♂）的杂交子一代为亲本获得的杂交子二代，其在早期发育阶段，已表现出了明显的生长优势[16]，是生长性能好、抗逆性强的潜力品种之一。从前期研究中，已了解杂交鲷与黑鲷的最佳投喂频次，杂交鲷相对具有更优的生长性能[1]。现分析比较投喂频率对杂交鲷和黑鲷的体成分、血清生化及基因表达等影响，深入了解投喂频率对其影响的机制，拟为其个性化投喂管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼来源

试验鱼为江苏省海水增养殖技术及种苗中心繁育的健康幼鱼。随机抽取规格一致的个体进行试验，其中杂交鲷体质量（6.42±0.14）g，体长（5.70±0.11）cm；黑鲷体质量（6.52±0.23）g，体长（5.86±0.14）cm。

1.2 试验设计

试验前，将试验鱼暂养1 周。共设置4 个投喂频率组（1~4 次/d，简称 1 T—4 T）。相同投喂频率的2 种鱼，饲养于同一室内水泥池不同网箱中，网箱尺寸为1.0 m×1.0 m×1.2 m，3 个网箱并排为 1 组（即3 个试验重复），2 种鱼放养密度均为60 尾/网箱。各试验组投喂及日常管理方法一致。投喂频率和投喂时间见表1。饱食投喂粗蛋白≥40.0%的海水鱼配合饲料，饲料粒径大小依鱼体生长过程而调整。试验期间，水质因子采用在线探头监测，水温22~29 ℃，pH 值 7.5~8.2，盐度 2.9%~3.0%，ρ（氨氮）<0.2 mg/L。24 h 持续充气，水中 ρ（溶解氧）大于6.0 mg/L。每日换水1 次，日换水量为池水量的50%~80%，自然光照。

表1 杂交鲷及黑鲷的投喂频率和投喂时间

1.3 样品采集与指标测定

养殖40 d 后，试验鱼停止投喂24 h 后开始取样。取样时，从每个网箱里随机各抽取6 尾鱼，于鱼尾静脉取血，4 ℃冰箱静置 12 h 后，4 ℃、4 500 r/min离心20 min，取血清于-80 ℃保存备用；快速解剖，取肝脏、肌肉等组织速冻于液氮中，后置于-80 ℃冰箱冷冻保存。

1.3.1 体成分测定

取肌肉测定体成分。粗脂肪（crude fat, EE）、粗蛋白（crude protein, CP）、水分（moisture）、灰分（ash）等分别按《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）《食品安全国家标准食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）《食品安全国家标准食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）进行测定。

1.3.2 血清生化指标测定

取血清测定血清生化指标。皮质醇（cortisol,COR）、总胆固醇（total-cholesterol, TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、总蛋白（total protein,TP）、溶菌酶（lysozyme,LZM）活性均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。

1.3.3 基因表达量测定

取肝脏组织用于测定相关基因表达量。使用Trizol 法提取杂交鲷及黑鲷肝脏组织总RNA，采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa, #RR047A）反转录试剂盒合成cDNA，并置于-20 ℃保存待用。根据黑鲷基因组中的相关基因序列，应用Primer 5.0软件设计特异性引物，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列见表2。采用SYBR Green 荧光嵌合法，利用BIO-RAD CFX ConnectTM荧光定量PCR 检测系统，进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性3 min；循环条件：95 ℃变性 10 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸20 s，75 ℃最后延伸 5 s，共进行 40 个循环。反应完成后绘制熔解曲线，熔解反应条件为：65~95 ℃，每5 s 升温0.5 ℃。选取actin作为内参基因，对各组织样本进行标准化，采用2-ΔΔCt 法进行计算基因相对表达量。

表2 实时定量PCR 引物

1.4 数据统计与分析

应用Excel 2019 和SPSS.22 统计软件分析试验数据，结果以“平均值±标准误（mean±SE）”表示，差异显著（P<0.05）时，再采用Duncan 法，进行组间差异的多重比较。

2 结果与分析

2.1 杂交鲷及黑鲷体成分的变化差异

由体成分检测结果得出，同一投喂频率的2 种鱼的各个体成分指标均无显著差异（P>0.05），见表3。随着投喂频率的升高，杂交鲷和黑鲷的粗脂肪含量呈升高的趋势，且1 T 组显著低于4 T 组（P<0.05）；而鱼体的水分含量呈降低的趋势，1 T 组显著高于4 T 组（P<0.05）。投喂频率对 2 种鱼的粗蛋白、灰分含量均无显著影响（P>0.05）。

表3 不同投喂频率下杂交鲷及黑鲷体成分的变化差异① %

2.2 杂交鲷及黑鲷血清生化指标的变化差异

血清生化检测结果表明，随着投喂频率的升高，杂交鲷的TC 及黑鲷的TC、TG 含量也逐渐升高，1 T组显著低于 4 T 组（P<0.05），但与 2 T、3 T 组间无显著差异（P>0.05）。杂交鲷和黑鲷的TP 随着投喂频率的升高呈先升高后降低的趋势，2 T 组显著高于 4 T 组（P<0.05）。杂交鲷在 4 T 组的 TC、TG 含量显著低于黑鲷（P<0.05），见图1。此外，皮质醇和溶菌酶指标，不因鱼种及投喂频率的不同而变化。

图1 不同投喂频率下杂交鲷及黑鲷血清生化指标的比较

2.3 杂交鲷及黑鲷相关基因表达量的变化差异

2 种鱼的相关基因表达水平受投喂频率不同程度的影响，不同投喂频率下杂交鲷及黑鲷相关基因相对表达量的比较见图2。由图2 可见，投喂频率从1 T升至3 T 时，杂交鲷及黑鲷的ghr 基因表达量显著降低（P<0.05）；igf1 基因相对表达量显著升高（P<0.05），Cu/Zn sod 基因表达量无显著变化（P＞0.05）；lpl 基因表达量则呈先升高后降低的趋势，2 T 组显著高于1 T组和 3 T 组（P<0.05）。投喂频率从 3 T 升高至 4 T 时，ghr、igf1、lpl、Cu/Zn sod 基因表达量均无显著变化（P>0.05）。4 T 组 lpl、ghr 基因表达量显著低于 2 T 组，Cu/Zn sod 基因表达量显著高于2 T 组。此外，杂交鲷在2 T组的 igf1、lpl 基因表达量显著高于黑鲷（P<0.05），1 T组的 ghr 基因表达量显著低于黑鲷（P<0.05），4 T 组的Cu/Zn sod 基因表达量显著高于黑鲷（P<0.05）。

图2 不同投喂频率下杂交鲷及黑鲷相关基因相对表达量的比较

3 讨论

3.1 体成分检测结果

鱼体成分是被用来评估鱼体质量、评判投喂策略的标准之一[17]。该试验中，随着投喂频率的升高，杂交鲷和黑鲷的粗脂肪含量升高，水分含量降低。对大杂交鲟（Huso dauricus♀×Acipenser schrenckii♂）[18]、黄河鲤鱼（Cyprinus carpio）[19]、花羔红点鲑（Salvelinus malma）[20]等幼鱼的研究，也得到了相似的结果。这可能是因为增加投喂频率，鱼类的饲料摄食量增大，因此鱼体中转化储藏起来的脂肪含量也随之增大[21-22]。但鱼种或饲料成分等的不同，也存在不同的研究结果[23]。另外，投喂频率对2 种鱼的粗蛋白、灰分含量均无显著影响。文献[24-25]关于乌苏里拟鲿（Pseudobagrus ussuriensis）幼鱼、阴影施氏油鲶（Steindachneridion scriptum）幼鱼的研究结果与本试验结果相似。推测是蛋白质和灰分含量涉及鱼体组织功能，不易受投喂频率等外源因素的影响[26]。但也有研究认为，部分鱼类在饥饿状态下，优先利用脂类与糖原供能，蛋白质的消耗少，粗蛋白含量相对较高[27]。

3.2 血清生化指标

COR 是由肾上腺皮质分泌的一种“应激激素”，与鱼体的代谢、免疫功能有关，而LZM 是参与免疫、抗菌抗病的碱性酶[28-29]。本试验中，投喂频率对2 种鱼的 COR、LZM 含量无显著影响。文献[30-31]对大口黑鲈（Micropterus salmoides）、花鳗鲡（Anguilla marmorata）等的研究也有同样结果。推测投喂频率的改变对多数鱼类的免疫功能不会造成影响。但也有个别鱼类如团头鲂[10]、哲罗鱼（Hucho taimen）[32]等的COR 和LZM 活性，受到了投喂频率的显著影响，这可能是高摄食量对其产生了应激反应。而TP 含量是体现鱼体营养状况相关的重要指标[33]。投喂频率升高时，杂交鲷和黑鲷的TP 含量先升高后降低，且2 T 组显著高于4 T 组。文献[18]对研究的大杂交鲟TP 含量变化趋势与本试验相似，这或许是因为超出适宜范围的高投喂频率，影响到鱼体的营养吸收。而花鳗鲡的TP 含量不因投喂频率变化而发生改变，只与自身的合成代谢相关[31]。TC 和TG 含量与鱼体的脂代谢有关[34]。因此，随着投喂频率的升高，2 种鱼的TC 含量及黑鲷的TG 含量均呈显著升高趋势，这与文献[35-36]关于吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）、条纹锯（Centropristis striata）的研究结果一致。此外，4 T 组内杂交鲷的TC、TG 含量显著低于黑鲷。可见，在高投喂频率组中，黑鲷更容易在体内积累由多余的养分转化而成的脂肪。

3.3 不同基因表达水平

类胰岛素生长因子（igf1）的基因表达，受鱼类营养贫瘠状况的影响[37-38]。升高投喂频率到2 T，igf1 的表达水平随之升高。生长激素受体（ghr）是检验鱼类生长性能和生理状态的指标，其在细胞内的表达量对生长激素发挥作用有重要影响[39]。本试验中，在较低投喂频率下，2 种鱼的ghr 基因表达处于较高水平。其原因可能是投喂量较少时，鱼体通过自身调节，上调ghr 表达，以减少营养不足对生长性能的影响，ghr 表达量也随之升高[40]。此外，2 种鱼的igf1 与生长速率呈正相关，ghr 与生长速率呈负相关，对多数鱼的研究都得到了该结果[41]。而同一投喂频率下，杂交鲷ghr 表达量低于黑鲷，igf1 表达量高于黑鲷，这在一定程度上反映杂交鲷的生长速度或许比黑鲷更快。

鱼种的脂蛋白脂肪酶（LPL）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达，亦受能量与营养的影响[42-43]。本试验中，日投喂1 次时，2 种鱼生长所需的营养不足，脂肪积累少，lpl 与Cu/Zn sod 基因表达均处于较低的水平；投喂2 次时，进食量加大，鱼体脂肪含量升高，LPL分解甘油三酯为机体供能，lpl 及Cu/Zn sod 基因表达均显著上调[44]；投喂4 次时，鱼体脂代谢紊乱，胃肠负荷加大，加之摄食活动增加，lpl 消耗量上升，其表达量下降，而机体通过自我调节恢复平衡后，Cu/Zn sod表达量降低[45-46]。此外，杂交鲷2 T 组的lpl 基因与4 T组的Cu/Zn sod 基因表达量，均显著高于黑鲷，表明杂交鲷的脂代谢平衡能力与抗氧化能力优于黑鲷。