慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者外周血中髓源性抑制细胞的变化及临床意义

吴会会， 杨珺， 曾炫富， 王娅， 王胜军,， 马永明

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科，江苏 镇江 212002； 3. 江苏大学附属人民医院检验科，江苏 镇江 212002)

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic sinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是多种炎性细胞参与并累及鼻腔和鼻窦黏膜的慢性炎性疾病，主要采用手术切除及辅以术后药物治疗，然而由于CRSwNP的具体发病机制不明，鼻息肉术后复发一直是困扰耳鼻喉科医生的难题。CRSwNP最显著的病理学特征是炎性细胞大量浸润，其中约20%的细胞是嗜酸性粒细胞，相关研究显示B细胞、浆细胞、特异性IgE在鼻息肉组织中表达上升[1-2]。

髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一类骨髓来源的、不成熟的且具有高度异质性的细胞群体，参与癌症、慢性炎症、感染、创伤、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等多种疾病的发生发展[3-5]。MDSCs在慢性炎症条件下持续产生炎性细胞因子、趋化因子和生长因子，IL-6可通过STAT3依赖性机制上调MDSCs中趋化因子受体5(chemotactic cytokine receptor-5，CCR5)和精氨酸酶-1(arginase-1，ARG-1)的表达[6]。MDSCs根据表面标志的不同分为HLA-DR-CD11b+CD33+MDSCs或HLA-DR-CD11b+CD33+CD14-CD15+粒细胞性MDSCs(PMN-MDSCs)，以及HLA-DR-CD11b+CD33+CD14+CD15-单核细胞性MDSCs(M-MDSCs)两个亚型[7-8]。免疫抑制是MDSCs的主要特征，MDSCs介导的免疫抑制包括ARG-1、诱导型一氧化氮(iNOS)、活性氧和程序性细胞死亡配体1。MDSCs大量产生iNOS和ARG-1，通过促进NO和活性氧产生而直接抑制T细胞功能[9]，而且其产生的ARG-1消耗精氨酸，使T细胞信号转导障碍[10]。也有研究表明，在系统性红斑狼疮中MDSCs依赖ARG-1促进Th17细胞的分化[11]。本研究拟探讨MDSCs是否参与了CRSwNP的发病过程，具体是哪一亚群参与了这一过程。

1 材料与方法

1.1 临床血液标本

收集2020年5月至2021年6月江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科收治的CRSwNP患者31例，其中男20例，女11例，年龄17～76岁，平均49.37岁。所有患者均依据中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南(2018)[12]的诊疗标准明确诊断为CRSwNP，患者在门诊行鼻内镜检查，鼻窦CT薄层平扫确诊为CRSwNP。所有纳入研究的患者至少在手术前3个月内停用全身糖皮质激素，手术前1个月内停用鼻用糖皮质激素以及抗白三烯药物。36例经鼻窦薄层CT平扫确定无鼻窦炎鼻息肉的健康受试者被纳入作为对照组，其中男20例，女16例，年龄20～79岁，平均44.50岁。取对照组和患者的EDTA抗凝外周静脉血样本，由于标本的采集时间跨度较大，因此并非每个标本都进行了所有实验。本研究通过医院伦理委员会审核，受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

流式抗体抗人HLA-DR(PE-Cy7)、抗人CD11b(Brilliant Violent 510TM)、抗人CD33(FITC)、抗人CD14(APC)、抗人CD15(PE)(美国Biolegend公司)；抗人ARG1(PE)(英国eBioscience公司)；样本密度分离液(天津灏洋华科生物科技有限公司)；细胞内固定缓冲液、破膜缓冲液(美国Thermo Fisher公司)；人IL-6 ELISA试剂盒(南京福麦斯生物科技有限公司)；超速离心机、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.3 提取外周血单个核细胞和血浆

取2 mL新鲜外周血(EDTA抗凝)，采用样本密度分离液分离得到外周血单个核细胞和血浆，外周血单个核细胞立即进行实验，血浆存放于-80 ℃短期保存。

1.4 流式细胞术检测MDSCs比例

调整单个细胞悬液细胞数量为106/100 μL缓冲液，加入单克隆HLA-DR(PE-Cy7)、CD11b(Brilliant Violent 510TM)、CD33(FITC)、CD14(APC)、CD15(PE)流式抗体，4 ℃条件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，500×g离心10 min，200 mL PBS重悬细胞，上机检测目的细胞比例。

1.5 流式细胞术检测MDSCs细胞内ARG-1的表达水平

调整单个细胞悬液细胞数量为106/100 μL缓冲液，加入单克隆HLA-DR(PE-Cy7)、CD11b(Brilliant Violent 510TM)、CD33(FITC)流式抗体，4 ℃条件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，以300×g离心10 min，加入500 μL固定缓冲液，混匀，室温条件下避光孵育15 min后，加入1 mL破膜缓冲液清洗2遍，300×g离心5 min，弃上清液，用50 μL破膜缓冲液重悬，加入抗人ARG-1(PE)，4 ℃条件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，500×g离心10 min，200 μL缓冲液重悬细胞，上机检测HLA-DR-CD11b+CD33+总MDSCs细胞内ARG-1细胞的表达情况。

1.6 ELISA检测CRSwNP患者血浆IL-6的浓度

取-80 ℃条件保存的血浆100 μL，放至室温，用IL-6 ELISA试剂盒检测CRSwNP患者血浆IL-6的浓度，按照说明书的步骤进行操作，在酶标仪上450 nm处读取各孔的光密度值，根据绘制的标准曲线换算后得到血浆IL-6浓度值，每组重复3次取平均数为检测结果。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 CRSwNP患者外周血总MDSCs和PMN-MDSCs的比例升高，G-MDSCs的比例降低

CRSwNP患者外周血HLA-DR-CD11b+CD33+MDSCs细胞的比例(1.20%±0.92%)与对照组(0.49%±0.59%)相比显著升高，差异有统计学意义(t=3.77,P<0.01)；CRSwNP患者HLA-DR-CD11b+CD33+CD14-CD15+PMN-MDSCs的细胞比例(56.52%±24.63%)与对照组(39.97%±26.86%)相比显著升高，而HLA-DR-CD11b+CD33+CD14+CD15-M-MDSCs细胞比例(16.82%±14.71%)与对照组(25.77%±19.97%)相比显著降低，差异均有统计学意义(t=2.59,t=2.01,P均<0.05)。见图1。

图1 MDSCs及其亚群在外周血中的变化

2.2 CRSwNP患者外周血总MDSCs中ARG-1的表达增加

CRSwNP患者外周血总MDSCs中ARG-1的平均荧光强度(4 455±1 476)与对照组(2 584±1 151)相比显著升高，差异有统计学意义(t=2.81,P<0.05)。见图2。

图2 总MDSCs细胞内ARG-1的表达

2.3 CRSwNP患者血浆IL-6的浓度升高

CRSwNP患者血浆中IL-6浓度(15.48±8.54) pg/mL与对照组(8.27±3.49) pg/mL比较显著升高，差异有统计学意义(t=2.24,P<0.05)。见图3。

图3 血浆中IL-6浓度比较

3 讨论

CRSwNP是耳鼻咽喉头颈外科的常见病、多发病，虽然近年来对CRSwNP的研究取得了较大进展，但对其确切的发病机制仍知之甚少[13]。CRSwNP作为慢性鼻窦炎的一种类型，其发病或复发与病原微生物的感染、过敏性鼻炎、鼻腔结构不良、纤毛功能不良、免疫功能异常等多种因素有关。目前研究表明CRSwNP具有高度的异质性，不同种族、国家乃至不同地区的CRSwNP具有不同的免疫病理学特点[14]。CRSwNP病理生理学基础是一种Th2主导的、持续的嗜酸性粒细胞炎症，虽然目前一般认为在白种人中Th2细胞因子环境以及组织的嗜酸性粒细胞浸润是其主要病理特点，但在中国仍有将近一半的CRSwNP患者表现为Th2细胞因子环境以及嗜酸粒细胞性炎症[15-18]。

关于MDSCs的报道始于20世纪70年代，Fu等[19]研究表明，各种类型的髓样细胞可以抑制癌症的免疫功能。但是，这些细胞的具体性质和生物学意义在很大程度上仍不清楚。有研究认为Gr1+CD11b+细胞表型定义了小鼠脾脏中的免疫抑制髓系细胞，然而很快就发现CD11b+Gr-1+细胞是异质性的。不同的表型标准和多种作用机制被用来定义这些细胞。2000年，为了统一对这些细胞的描述，提出了MDSCs这个名称。MDSCs在健康条件下无法检测到，但在怀孕期间、新生儿和病理情况下(如肿瘤或慢性感染)可检测到[20]。MDSCs是慢性炎症的标志，可以提高癌症患者对免疫治疗的耐受力，因此消除MDSCs是目前的共识，并且在肿瘤的免疫治疗中靶向MDSCs取得了令人欣喜的进展[21]。

本研究通过流式细胞术检测发现CRSwNP患者外周血中总MDSCs和PMN-MDSCs细胞比例明显升高，而M-MDSCs细胞比例显著降低，进一步通过酶联免疫吸附技术检测发现CRSwNP患者血浆IL-6浓度显著升高。推测造成这一现象的原因可能是当机体处于慢性炎症的病理环境下，包括IL-6在内的细胞因子或炎症因子大量产生，这些细胞因子不仅可以阻滞不成熟髓系细胞的正常分化，还能诱导其成为MDSCs，并在患者外周血、骨髓或肿瘤组织内大量募集、扩增、活化，通过抑制特异性免疫和非特异性免疫发挥其免疫抑制作用[22]。也有研究表明在肿瘤微环境中，MDSCs可与T细胞竞争使用对T细胞激活和增殖至关重要的半胱氨酸，导致T细胞不能从头合成，从而阻碍抗肿瘤T细胞的产生，促进肿瘤的进展[23-24]。IL-6是参与MDSCs分化的重要细胞因子，有研究表明与没有IL-6参与分化的MDSCs相比，在IL-6存在下分化的MDSCs有更强的抑制CD8+T细胞的功能[6，25]。研究表明MDSCs产生ARG-1，ARG-1既可以通过促进产生活性氧而直接抑制T细胞功能，又可以消耗精氨酸，使T细胞信号转导障碍，而通过流式细胞术进行细胞内染色发现总MDSCs细胞内ARG-1的表达明显升高。因此推测在鼻息肉的长期慢性炎症刺激下，MDSCs通过产生ARG-1促进活性氧的产生，进而抑制T细胞的功能。由于条件限制，本课题只研究了总MDSCs中ARG-1的表达情况，没有进一步研究是MDSCs的哪一亚群的变化导致ARG-1的升高。

机体在CRSwNP的长期慢性炎症刺激下产生IL-6等炎症因子，导致MDSCs的分化增多，增多的MDSCs通过产生ARG-1从而抑制T细胞的免疫功能，而鼻黏膜在长期慢性炎症的刺激下导致了鼻息肉的形成。课题组将进一步完善相关分子机制的研究，为CRSwNP的干预治疗提供实验依据。