植物免疫诱抗剂研究文献计量可视化分析

吴宇炼，范慧艳，汪彦欣，徐凯逸，邵承媛

（1浙江中医药大学药学院，杭州310053；2杭州市农业技术推广中心，杭州 310053）

0 引言

植物免疫诱抗剂作为一种生物农药，又被称为“植物疫苗”，是当前国际上热门的研究领域。当作物受到外界刺激时，会自发产生免疫反应，植物免疫诱抗剂可以增强植物自身免疫力，提高对致病因子的抵抗力[1]。科学家们通过揭示植物、病虫害、生物农药三者关系，实践发现了植物免疫诱抗剂，以此有效提高农作物抗性来防控农作物病害的发生。据不完全统计，当前已鉴定的植物免疫诱抗剂种类多样，氨基寡糖类与蛋白质类植物免疫诱抗剂是当前应用较为广泛的植物免疫诱抗剂[2]。作为巨大发展前景的战略产业和新型生物农药，植物免疫诱抗剂是在人用疫苗、动物疫苗后，疫苗工程方面的新方向。因此对国内外植物免疫诱抗剂的相关文献进行归纳、分析和总结，对于中国构建植物免疫诱抗剂研发与作用评价技术体系，明确植物免疫诱抗剂作用靶标、受体识别及关键激活位点具有重要意义。文献计量学是用数学和统计学相结合的方法，定量分析一切知识载体的交叉科学。文献计量学能够基于真实数据分析共被引文献、共现词等，可视化分析植物免疫诱抗剂领域研究热点及科研动态，并且能够预测植物免疫诱抗剂的发展趋势[3]。长期以来，人们主要使用以病原菌为靶标的化学农药，通过直接杀死病原菌来防治植物病害。但化学农药大面积喷洒，不仅增加生产成本和农产品、土壤农药残留，而且易导致病原菌产生抗药性，从而造成恶性循环，严重制约了农业的可持续发展也危害了人类身体健康。寻找经济高效、安全环保的植物保护新方法、新技术十分必要[4]，而植物免疫诱抗剂正是这样一种新的化学农药替代品。目前，有关植物免疫诱抗剂的各类研究都发展较快，利用文献计量可视化方法可以明确其发展趋势并为生物农药创制提供新思路。

1 数据来源和研究方法

1.1 数据来源

从Web of Science(WOS)核心合集数据库和中国国家知识基础设施(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)期刊论文数据库下载植物免疫诱抗剂的相关文献并进行计量分析。首先，在CNKI数据库，利用高级检索输入((主题%=′植物免疫诱抗剂′or题名%=′植物免疫诱抗剂′or title=xls(′植物免疫诱抗剂′)or v_subject=xls(′植物免疫诱抗剂′))OR(主题%=′植物疫苗′or题名%=′植物疫苗′or title=xls(′植物疫苗′)or v_subject=xls(′植物疫苗′)))AND(发表时间 Between(′1985-01-01′,′2021-12-09′))；检索范围 ：总库 ，中文文献。其次，在WOS核心合集数据库，利用基本检索输入主题：(plant immune inducer)OR主题：(plant immune inducers)OR主题：(plant immunity inducers)OR主题：(plant vaccine)OR主题：(plant vaccines)。关键词和共被引部分，在WOS核心合集数据库，利用基本检索输入主题：(plant immune inducer)OR主题：(plant immune inducers)OR主题：(plant immunity inducers)。

1.2 研究方法

利用文献计量学方法对1985年1月1日—2021年12月9日的文献进行统计分析；最后利用Citespace软件分析工具、CNKI可视化分析和Excel，对CNKI中的检索结果和WOS核心文集中的数据进行可视化分析，绘制出“植物免疫诱抗剂”领域的科学知识图谱，揭示了中国植物免疫诱抗剂的研究进展和研究热点。

2 植物免疫诱抗剂研究文献计量分析

2.1 文献发表年份

通过在CNKI中进行主题词检索，得到发表于1985—2021年的有关植物免疫诱抗剂的中文文献812篇，筛选、除重后剩余784篇。整体发文量呈现波动增长趋势，2000年以后发文量开始上升，2004—2006年增长迅速，发文数量在2006年达到顶峰，之后开始下降。随着植物疫苗的不断发展，预测这一方面的研究的深度会不断提高（图1）。

图1 CNKI数据库中关于植物免疫诱抗剂的发文量

通过对WOS核心文集数据库进行主题词检索，得到发表于1985—2021年的有关植物免疫诱抗剂的文献，其中与植物免疫诱抗剂相关的文献为2640篇，经除重后剩余文献2634篇，将发表文献较多的近14年的文献做成折线图，发现近10年发文量呈波动式增长（图2），2019—2020年增长迅速。

图2 WOS核心文集数据库中关于植物免疫诱抗剂的发文量

2.2 文献来源地域分布

对WOS核心合集数据库中检索到的关于植物免疫诱抗剂的英文文献进行分析，发现北美洲发文量最多，占全部发文量的33.561%，其次是亚洲、欧洲，占比分别为29.347%、17.312%。植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的国家中亚洲国家最多，包括中国、印度、韩国和日本，其次是美洲国家，包括美国、加拿大、墨西哥，欧洲国家中，英国、德国、意大利进入前10名。随着化学农药对环境的破坏愈加显现，各大洲的国家对植物免疫诱抗剂这种新型生物农药的研究都在逐渐深入（表1），各国之间的合作也在进一步加深，从植物免疫诱抗剂国家合作网络中发现美国发文量最多，且与其他国家有一定的合作研究，研究成果的国际影响力也较高。中介中心性是在国家合作网络中评价相关国家的重要指标，中介中心性值越高，代表节点的重要性越大。一个节点代表一个国家，节点越大，代表该国家的发文量越多，节点之间的连线表示国家之间的合作[5]。以下植物免疫诱抗剂研究国家合作网络中与美国合作的国家最多（图3），虽然中国在该研究领域发文量处于前列，但与美国相比差距较大，国际影响力较低，还需要加强与其他国家之间的合作。

图3 1985—2021年植物免疫诱抗剂研究国家合作网络图谱

表1 1985—2021年植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的国家

2.3 文献来源机构、作者及期刊分布

从WOS核心合集数据库中可以看出，发文量排名前10名的机构中包含美国的亚利桑那州立大学、加州大学，以及墨西哥的圣路易斯波托西自治大学和墨西哥国立自治大学，其中，发文量前2名分别为墨西哥的圣路易斯波托西自治大学和美国的亚利桑那州立大学，分别占总发文量的2.619%和2.581%（表2）。在WOS核心合集数据库中，ROSALES-MENDOZA S发表文献最多，为68篇（表3）。发表论文最多的英文期刊是Vaccine（表4），占比约5.277%。从CNKI数据库中可以看出山东省秸秆生物工程技术研究中心、石河子大学的中文发文量较多，分别占比约2.68%和2.55%（表5），张世明、刘波和郑雪芳等对该领域比较关注，发文量增长迅速（表6）。

表2 WOS核心文集数据库中关于植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的机构

表3 WOS核心文集数据库中关于植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的作者

表4 WOS核心文集数据库中关于植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的期刊

表5 CNKI数据库中关于植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的机构

表6 CNKI数据库中关于植物免疫诱抗剂发文量排名前10名的作者

2.4 高频次关键词分析

用CiteSpace软件进行关键词共现分析，提取关于植物免疫诱抗剂的研究热点，选取1985—2021年中出现频次最高的前30个关键词，调整得到植物免疫诱抗剂关键词共现网络图谱（图4），通过对国外文献关键词共现性分析发现，植物免疫诱抗剂相关的研究热点是水杨酸(salicylic acid)、植物诱导抗性(induced resistance)、植物抗病性(disease resistance)等（图 4）。经过对中文文献的筛选后，发现植物免疫诱抗剂的研究热点主要是植物免疫诱抗剂中氨基寡糖素类的应用、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、秸秆反应堆技术、以秸秆替代化肥、以植物疫苗替代农药、以及利用植物免疫诱抗剂提高作物产量等（图5）。

图4 1985—2021年WOS核心合集数据库有关植物免疫诱抗剂研究高频次关键词共现网络图谱

图5 1985—2021年CNKI数据库中有关植物免疫诱抗剂研究高频次关键词共现网络图谱

2.5 文献共被引分析

基于WOS核心合集数据库中2002—2021年发表的关于植物免疫诱抗剂的文献，利用CiteSpace的Reference功能来进行文献共被引分析。首先，选取每一年中被引次数最高的前30篇引文，构建共被引网络图谱（图6）。可以通过共被引文献，找出这一领域被引最多最有影响力的文章和作者。其中被引最多、最有影响力的文献是Spoel SH在2012年发表的How do plants achieve immunity?Defence without specialized immune cells[6]，中介中心性最大，研究了植物通过一个自我监控、系统信号和染色体变化组成的多层植物先天免疫系统从而获得特异的、自我耐受的免疫力。被引次数最多的作者是Jones JDG，他的研究方向主要是植物遗传学，研究了植物的2种固有免疫系统对病原物侵染作出的反应。第一种识别并响应许多微生物共有的分子，包括非致病菌。第二种是响应直接影响宿主目标的病原体毒力因子[7]。

图6 2002—2021年WOS核心合集数据库有关植物免疫诱抗剂研究共被引文献网络图谱

图7 2002—2021年WOS核心合集数据库有关植物免疫诱抗剂研究共被引作者网络图谱

3 植物免疫诱抗剂进展

从高频次关键词分析中发现植物免疫诱抗剂的研究热点主要是水杨酸类、氨基寡糖素类植物免疫诱抗剂，青枯雷尔氏菌病虫害防治、秸秆反应堆技术，以及农作物栽培等方面。最初被发现的植物免疫诱抗剂是有机酸类植物免疫诱抗剂，它出现得较早，水杨酸(Salicylic acid,SA)是植物免疫诱抗剂的原材料[8]，它也可以发挥化学诱抗作用，是植物获得抗病性过程中防御信号传递的关键物质之一，可促进植株抗病基因表达[9-10]，进而影响植物的生长速率、光合作用、抗氧化能力等生理指标。用SA(110 ml/L)喷施西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)侵染的南瓜叶片，发现病毒侵染过的植株叶片表面出现了严重叶片黄化、缩小、变形等症状。而SA喷施过的植株，蛋白质和碳水化合物含量显著增加[11-12]。而水杨酸诱导西葫芦抗病毒侵染这一过程是通过抗氧化系统来实现的。水杨酸还可以保护被菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus,BYMV)侵染的蚕豆叶片，研究表明喷施SA后叶绿体、基粒和类囊体内部结构均有扩张[13]。此外，有研究表明SA能够减轻烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)所引起的症状，并且诱导PR蛋白的积累[14]。SA在不同类型细胞中对相同病原的作用不同，通过以表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的TMV和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)为材料，发现SA处理的烟草表皮细胞中TMV复制不受影响，但是其运动受阻导致叶肉细胞中TMV复制受到影响[15]。另外还发现了有些无机化合物也能诱导植物产生抗性，如磷酸钾、磷酸氢二钾等磷酸盐能在黄瓜第1、2真叶下部诱导3、4叶对炭疽病的系统抗性[16]。氨基寡糖素是一种新型植物免疫诱抗剂，可以通过激活免疫系统而获得抗病性。它又称为农业专用壳寡糖，是D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接的低聚糖，可以由微生物发酵提取或由几丁质降解得到壳聚糖后再降解制得，分为固态和液态两种。氨基寡糖素是绿色、无公害的生物农药，可以被微生物分解，改变对土壤微生物区系。氨基寡糖素5%(AS)对水稻稻痘病、西瓜枯萎病、烟草病毒病、棉花黄萎病和番茄叶霉病等病害都有较好的防治效果，对葡萄品质的提高效果明显[17]。近年来，关于氨基寡糖素在病害防治方面已有相关报道，2.0%氨基寡糖素可以有效控制番茄病毒病和晚疫病并增强其抗病能力[18]，对灰霉病的防治效果不理想，但可以提高作物的品质[19-20]；2.0%氨基寡糖素（500倍）可以防治西瓜病毒病，对西瓜生长有促进作用[21]；对黄瓜白粉病菌侵染有抑制作用[22]；对于辣椒疫病、病毒病、枯萎病[23-24]和槟榔黄化病[25]等均有防治作用。可以有效促进辣椒营养生长[26]，对猕猴桃抗寒、诱导免疫反应、增产等均效果显著[27-28]。5%海岛素还可以有效防止高温对中稻的伤害[29-30]，提高小麦出苗率，增强抗逆性[31]，可以诱导豇豆产生抗寒能力，最终实现这些蔬菜增产[32-33]。截至2020年9月，中国农药信息网显示中国登记了76个氨基糖糖素农药产品，其主要剂型为水剂。氨基寡糖素应用广泛，对农作物增产、提高抗病性，推进植物免疫诱抗剂研究的发展具有重要的意义[34]。

植物免疫诱抗剂中的微生物菌剂在植物病害防治上的应用上最为突出，青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是世界十大植物病原细菌之一，寄主种类多，在烟草、芝麻、番茄上均有寄生，该菌菌系复杂、侵染途径多且生命力强，可在土壤中长期存活，这些因素使得青枯病防治难、发病重，而植物免疫诱抗剂可通过增强其自身抗病性达到防治效果[35]。除增强自身抗病性以外，植物免疫诱抗剂还可以提高作物品质，提高作物产量、种子发芽率，目前已在草莓[36]、葡萄[37]和玉米等植物栽培上广泛应用。植物免疫诱抗剂技术也是秸秆生物反应堆技术体系的重要组成部分，可以有效防治病虫害、提高作物产量，代替传统农药从而有效保护环境[38]。秸秆生物反应堆技术运用生物技术将秸秆转化，为农作物提供所需的有机、无机养料和抗病孢子等，增强农作物的防病抗病能力，并实现农业的增产、增质。

在外文文献高共被引文章和研究热点中，主要是植物免疫诱抗剂发现和作用机制的研究。植物免疫诱抗剂也称为植物生物刺激素[39]，苏联教授Filatov提出生物刺激论，植物在非致命的胁迫环境中，会促进新陈代谢[40-42]。1992年，美国科学家分离出能诱导烟草等植物产生过敏反应的一种蛋白质激发子——Harpin[43]。植物免疫诱抗剂对生物刺激素作用是通过激素效应，其次是通过抗氧化剂来实现提高光合作用效率等作用[44]。2014年美国学者指出植物生长促进微生物和生物控制微生物都可以促进植物生长发育以及增加植物的抗逆性[45]。随着科学的发展，科学家们进一步解析了植物免疫的相关机制，在病原菌和植物相互作用的初期，病原菌除了要突破植物表面的物理屏障，还要突破植物免疫系统[46]。植物为了躲避病原菌毒性因子的攻击，进化出了细胞膜表面模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)和病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)并激发一种较弱的抗性PTI(PAMP-triggered immunity)。为了抑制抗性，病原菌产生效应分子进入植物细胞，植物又再进化出相应的抗病蛋白，二者相互斗争。根据植物免疫诱抗性的特点，植物免疫诱抗剂是能够激发植物免疫的激发子[47]。生物农药也开始走进法案中，2018年美国首次在法规中提出农用生物刺激素的定义，在法规下对其进行管理[48]。2019年欧盟通过了新的肥料法规，除了增加植物生物刺激素的定义外，还明确了生物刺激素不属于农药范畴，该法规将在2022年正式实施[49]。植物免疫诱抗剂作为一个世界热点产品类型，立法有利于其推广和管控。

近年来，植物免疫诱抗剂在农作物应用上更加广泛，但其也存在着水溶性差、递送效率低的问题，严重制约着其进一步发展和应用。郑康凯等提出了一种结构简单、成本低、环保的纳米级星状聚合阳离子(Star Polycation,SPc)，以分子间作用力或包埋方式承载药物活性成分，通过形成稳定复合体，大幅减小植物免疫诱抗剂的粒径至纳米级。作为一种新型纳米载体递送免疫诱抗剂，大大提高了它在水溶液中的稳定性和分散性[50]。

中国作为一个农业大国，较大的化学农药使用面积不可避免，由此产生的问题也十分严重。虽然国家积极防治，但目前使用的农药依然以化学农药为主，存在较大的危害，且大面积的喷洒，也造成了土地污染，导致人民生活水平质量和农产品的国际竞争力大大降低[51]。2015年农业部提出化肥农药零增长计划[52]，《全国农药产业发展规划（2021—2025年）》中提出要支持农药创新与研发项目，作为绿色、环保的植物免疫诱抗剂有着巨大的发展潜力。从文献计量学的角度可以发现，中国在植物免疫诱抗剂的研究方面处于前列，预测未来几年植物免疫诱抗剂会广泛应用于农业。利用文献计量学方法分析植物免疫诱抗剂领域研究进展，可以对该领域的研究热点及未来研究方向有一个比较全面、清晰的认识，但这个研究结果会随时间改变，需要定期关注动态做出分析[53]。