不同浓度褪黑素对甜菜种子的引发影响

杨 然，兴 旺，刘大丽，吴则东，王茂芊

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜作为一种糖料作物，是最为重要的一种糖类的来源之一，目前已经遍布在中国极大多数地区，尤其是在黑、吉、辽所在的东北地区，甜菜的种植规模十分巨大，占到全国甜菜总种植面积的65%以上，内蒙古，新疆等地，也是甜菜种植的高产地区。虽然甜菜的种植规模庞大，但是甜菜对其生长过程的要求却相对严苛，即使它具有优异的耐寒性和喜温作物，却仍然存在着发芽速度慢，抗逆性差等缺点。因此，通过调节种子播种前吸水速度的快慢，为其种子萌发做好充足的各项生理准备后再缓慢回干的播前种子引发技术，就显得尤为重要[1]。中国虽说是粮食生产大国，但是与国外的种子引发和加工技术相比，中国在甜菜种子引发技术上，起步较晚，发展也较缓慢。因此，要想迅速加强中国甜菜产业的可持续发展，就必须要加强甜菜种子的引发和加工技术的研发力度[2]。

之所以研究甜菜种子引发技术，是由于在甜菜种子经过引发后，可以显著提高种子的发芽率，并明显改善了其抗逆性。这就可以起到节约甜菜种子，降低种子生产成本，提高种子综合效益的作用[3]。

随着农业领域发展和时代的不断更新进步，中国相关的农业科研工作者紧跟时事，越来越重视甜菜种子引发剂的研究。王宇光等[4]利用不同的钠离子浓度，在盐胁迫的条件下，对甜菜幼苗前期的生理特性进行了分析。白占兵等[5]研究种子引发剂对辣椒种子发芽的影响。宋子叶等[6]研究水、50 μmol/L氯化钠、0.05 μmol/L水杨酸和20%聚乙二醇4种完全不同的引发剂对小麦种子发芽的影响程度，结果显示，这4种引发剂均能明显地促进重度老化种子发芽。狄文伟等[7]对茄子种子进行引发效果的研究，结果表明：使用引发种子不但能够增强茄子种子的抗逆性，还能够减少茄子种子的发芽时间[8]。种子引发处理主要由以下几个因素所决定，即引发剂的种类选择、引发时所控制的温度、引发时间的长短等[9]。张丽等[10]用杂交玉米‘农大108’种子研究了不同浓度的PEG引发对玉米种子萌发及活力的影响。吴凌云等[11]研究了种子引发结合杀菌剂包衣处理对西瓜种子萌发和幼苗素质的影响。

经过国内外各种研究人员的探索和发现，种子引发的种类根据基质的不同，其方法也不止一种。具体方法包括滚筒引发、基质引发和膜引发。国内外的科研工作者对于种子引发的实验探索也越来越为深入和成熟，比如TARIQ等[12]就以赤霉素为例，探讨了它在低温胁迫的条件下，对鹰嘴豆幼苗的保护效果。LIU等[13]研究发现过氧化氢影响种子吸胀过程中ABA分解代谢和GA生物合成的调控，从而对种子休眠和萌发产生调控作用；较为普遍应用于部分蔬菜和花卉种子播种前的处理当中，在其他多种经济作物育种研究中也较为常见[14-15]。种子引发重新模拟了部分种子发育过程，在随后理想的回干过程中，完成种子活力的恢复或提升[16]。在引发过程中，同一物种或品种的引发效果可能会因为不同引发方法造成差异，甚至会因为引发方法的不同而得到截然不同的引发效果[17]。

迄今为止，国内外对于利用不同引发剂引发甜菜种子的研究数量少之又少，因此，本次研究实验配制了不同浓度的褪黑素溶液，褪黑素浸泡的时间分别为8、12、24 h。本实验旨在探讨在不同处理时期，不同浓度的褪黑素对甜菜种子发芽的作用，通过对发芽指数和活力指数的调查研究不同种子是否对同一引发剂有不同表现，从而也为选择优良的甜菜种子包衣剂提供有效的参考。

在甜菜种子的实际生产中，使用具有明显的引发作用的引发剂，为今后的甜菜种子引发剂的选用研究打下了良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2021年09月—2021年12月在黑龙江大学现代农业与生态环境学院甜菜遗传育种重点实验室进行。

1.2 试验材料

供试材料选用甜菜单粒种STm1619，由新疆石河子农业科学院甜菜所提供。

1.3 试验方法

本研究选用的引发剂为褪黑素（表1），共设置了9个处理，在23℃条件下，褪黑素的浓度分别设置为50、100、200 μmol/L，处理的时间分别为8、12、24 h；其中在不同的处理时间之下，9组处理试验的对照均为没有经过任何处理的原STm1619干种子。

表1 不同浓度的褪黑素的9个处理

本研究的引发处理试验在黑龙江大学现代农业与生态环境学院的甜菜品质监督检验测试中心进行。本实验的试验方法总结如下：（1）将实验室内准备好的纯净蒸馏水与0.1%浓度的次氯酸钠溶液一同倒入消毒灭菌后的桶中充分搅拌均匀，再将适当数量的发芽盒放入桶中进行清洗消毒、晾干，同时将消过毒保证无菌的50格发芽纸平坦铺在处理过后的发芽盒里，每个纸格放2粒种子，摆放均匀后使用注射器将34 mL的蒸馏水均匀喷进发芽盒里，且要求保证发芽盒里每个STm1619甜菜种子都湿润。每个处理进行3次重复，温箱培养温度设置为23℃，湿度为70%，光照时间为12 h。每天检测发芽种子数，调查统计出盒内处理过的STm1619甜菜种子发芽势和发芽率，通过测量甜菜发芽种子的胚根及肧轴的总长度，可以充分得到各处理的发芽指数和活力指数数值。

1.4 测定指标

通过公式测定引发剂处理后的甜菜种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数[式(1)～(4)]。利用Excel软件数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 50 μmol/L褪黑素不同时间处理STm1619甜菜种子的结果

结果（表2）显示，褪黑素溶液浓度为50 μmol/L，STm1619甜菜种子的处理时间分别为8、12、24 h，种子经过处理后，其发芽势分别为47.67%、59.33%和44.67%，均高于对照(17.00%)，分别高出了30.67%、42.33%和27.67%。发芽率分别为47.67%、60.33%和48.67%，均高于对照(19.00%)，分别高出了28.67%、41.33%和29.67%。由种子发芽指数和活力指数结果可见，50 μmol/L浓度的褪黑素溶液在不同的3个时间下，其种子处理的发芽指数分别为18.32、25.47和21.57，均高于对照(7.07)，分别高出 11.25、18.40 和14.50。种子的活力指数分别为159.51、189.38和142.57，均高于对照(52.79)，分别高出106.72、136.59和89.78。试验结果显示，在50 μmol/L浓度的褪黑素条件下，3个时期的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等指标都比对照组显著增高，显而易见，50 μmol/L浓度的褪黑素在8、12、24 h三个不同时间下处理STm1619甜菜种子时的引发作用效果显著。

表2 50 μmol/L浓度褪黑素处理STm1619甜菜种子萌发调查表

2.2 100 μmol/L褪黑素不同时间处理STm1619甜菜种子的结果

结果（表3）显示，褪黑素溶液浓度为100 μmol/L，STm1619甜菜种子的处理时间分别为8、12、24 h，种子处理后的发芽势分别为50.67%、54.33%和55.00%，均高于对照(41.00%)，分别高出了9.67%、13.33%和14.00%。发芽率分别为47.67%、57.33%、和56.00%，均高于对照(41.00%)，分别高出了6.67%、44.33%和15.00%。由发芽指数和活力指数结果可见，100 μmol/L浓度的褪黑素在不同的3个时间下，处理的发芽指数分别为19.25、22.54和24.52，均高于对照(13.17)，分别高出6.08、9.37和11.35。活力指数分别为142.14、178.78和154.72，均高于对照(114.02)，分别高出了28.12、64.76和40.70。综合结果可知，在100 μmol/L浓度的褪黑素条件之下，3个时期的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数都要略高于对照。综上所述，100 μmol/L浓度的褪黑素溶液在8、12、24 h三个不同时间下，处理STm1619甜菜种子时的引发效果都有一定的促进作用。

表3 100 μmol/L浓度褪黑素处理STm1619甜菜种子萌发调查表

2.3 200 μmol/L褪黑素不同时间处理STm1619甜菜种子的结果

结果（表4）显示，褪黑素溶液浓度为200 μmol/L，STm1619甜菜种子的处理时间分别为8、12、24 h，种子处理后的发芽势分别为42.00%、56.33%和53.00%，都要高于对照(25.00%)，分别高出了17.00%、31.33%和28.00%。发芽率分别为42.67%、56.67%和54.00%，均高于对照(26.00%)，分别高出了16.67%、30.67%和28.00%。从种子的发芽指数和活力指数数值的两方面分析可以看出来，在200 μmol/L浓度的褪黑素溶液处理中，3个时期的发芽指数分别为17.40、20.57和23.17，其数值均大于CK(8.26)，分别大了9.14、12.31和14.91。活力指数分别为110.08、121.77和136.51，均高于对照(74.67)，分别高出35.41、47.10和61.84。结果显示，200 μmol/L浓度的褪黑素在不同的3个时期处理甜菜种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数对于对照种子略有提高。从结果分析亦可看出，200 μmol/L浓度的褪黑素在8、12、24 h三个不同时间下处理STm1619甜菜种子时的引发效果都有显著的促进作用。

表4 200 μmol/L浓度褪黑素处理STm1619甜菜种子萌发调查表

2.4 不同浓度褪黑素不同时间处理比对

通过9个处理后的STm1619甜菜种子发芽势比较结果看出（图1），9个处理试验的发芽势数值相对于对照而言都高，以处理2的发芽势最高，高达59.33%。除CK组以外，发芽势最低的一组是处理7。由发芽率比较的结果又可以看出（图2），9个处理试验的发芽率较CK而言都高，以处理2的发芽率数值为最大，高达60.33%，发芽率数值最小的处理7，仅为42.47%。由发芽指数比较结果可以看出（图3），9种不同处理的发芽指数数值都明显大于CK组。结果表示，仅有处理2的发芽指数数值高于25，而处理1、4、7的发芽指数的数值都在20以下。从活力指数的比较结果可以清晰的看出（图4），9个处理的活力指数数值都要比对照高，处理1、2、5这3组的活力指数数值较高，从结果能够明显看出，处理2的种子活力指数数值最高，高达189.38，而处理7最低，仅为110.08。综合结果对比表明，褪黑素浓度不管是 50 μmol/L，100 μmol/L 还是200 μmol/L，其 在 8、12、24 h 的 处 理 时 间 下 对STm1619甜菜种子都有一定的引发作用。当褪黑素浓度为 50 μmol/L、处理时间为 12 h情况下，对STm1619甜菜种子的引发效果最好，可以大大提高甜菜种子的活力。

图1 不同浓度褪黑素发芽势比对

图2 不同浓度褪黑素发芽率比对

图3 不同浓度褪黑素发芽指数比对

图4 不同浓度褪黑素活力指数比对

2.5 STm1619甜菜种子活力的电导率测定

由于甜菜种子种类各不相同，其种子活力也有高低之分。一般来说，高活力种子相对于低活力种子而言，不仅它的细胞膜的损伤程度要小，而且重新构建细胞膜的速度快于低活力种子，其修复细胞膜的损伤程度也要远远优于低活力的种子。根据国内外的研究人员的探索发现，电导率就可以清晰地测定出甜菜种子活力的高低，它可以为试验所需要的甜菜种子提供一个较为精确的数值和指标。由于上述分析可知，往往高活力的甜菜种子所浸泡的溶液，它的电导率要低于低活力的甜菜种子。由于甜菜种子在所浸泡液中含有各种溶解盐类且以离子的形式存在，且随着其浸泡液中离子浓度大小的变化程度，可以清晰看出所需甜菜种子电导率大小以及与其种子活力的相关性。因此，为了更准确测定出实验所需的STm1619甜菜种子的活力大小，需要做一项关于种子活力电导率测定的实验。

甜菜种子电导率实验所需要的主要材料是若干颗STm1619甜菜干种子。实验的主要器具有：数值显示清晰且准确的电导率仪、250 mL规格的玻璃烧杯、纯净的蒸馏水、保鲜膜、玻璃棒、标签纸等。

电导率测定实验步骤如下（表5）：（1）首先准备好4个250 mL规格的玻璃烧杯，将其用纯净的蒸馏水冲洗干净后备用，取出约200颗左右的STm1619甜菜干种子并将其平均分为4组，每组约50颗。（2）将清洁完毕的玻璃烧杯中分别放置200 mL的蒸馏水并用准备好的标签纸在3个烧杯上分别贴上8、12、24 h和CK的标签（。3）按照上述实验步骤配置好浓度分别为50μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L的3组褪黑素溶液，另一烧杯放入200 mL的纯净蒸馏水作为对照。（4）将4组STm1619甜菜干种子放入配置好的3种不同浓度梯度的溶液和蒸馏水的烧杯之中，经过充分搅拌均匀后，用保鲜膜将玻璃杯封口，再分别静置浸泡8、12、24 h。（5）4组烧杯分别在8、12、24 h后揭开封口的保鲜膜，用数值显示清晰且精确的电导率仪测出浸泡液的电导率值，为了防止读数或其他因素产生的误差，每个时间段重复测定3次电导率值，最终取平均值计入数据。

表5 不同浓度褪黑素溶液电导率测定的处理

经过对实验数据的统计和分析，结果（表5）表明：50 μmol/L浓度的褪黑素溶液在经过8、12、24 h的时间下，电导率的数值为109.97、140.33和99.03，均高于对照(86.28)；100 μmol/L浓度的褪黑素溶液在经过8、12、24 h的时间下，电导率的数值为130.93、134.80、98.03，均高于对照(125.63)；200 μmol/L浓度的褪黑素溶液在经过8、12、24 h的时间下，电导率的数值为125.53、140.77、100.70，均高于对照(77.93)；总体看来，3组浸泡在褪黑素溶液中的电导率数值在8、12、24 h的处理时间下都要高于对照。STm1619甜菜种子在褪黑素溶液浸泡12 h的条件之下，其整体的电导率值最高，而在24 h的处理时间下其电导率的数值要低于8 h和12 h的处理时间，且最接近于对照。经过电导率测定的实验可以得出以下结论：褪黑素这一引发剂可以提高STm1619甜菜种子的活力，在不同时间的处理之下，种子的活力程度也各不相同。因此，种子经过适宜的时间和浓度处理，能够有效提高其活力，才能最终提高种子萌发的程度。

3 讨论

在种子引发过程中，常用的方法不仅有液体引发、固体基质引发、水引发，还有生物引发和膜引发等处理技术[18]。上述方法虽各有千秋，但其基本的原理都是：在一定的条件下使种子慢慢吸收水分，并在初期进行恰当的处理，从而达到发芽的目的[19]。液体引发剂因其使用简便、快速、容易使用等优点，在种子引发的过程中得以广泛应用[20-21]。目前很多作物种子采用液体引发的引发方法，如GIAVENO等[22]采用NaCl对14份玉米杂交种进行了耐盐性研究；HABIBI[23]研究盐胁迫下向日葵幼苗对外源硒的生理、光化学和离子响应。

褪黑素是一种吲哚类色胺，它参与了动物的昼夜节律的调节。现今发现褪黑素这一引发剂虽然广泛存在且已经被大量应用于各种高等作物中，但目前有关褪黑素在植物中的研究仍是少数[24]。HERNÀNDEZRUIZ[25]在多种植物上做了实验，提出褪黑素可能有类似于植物生长调节剂IAA的作用方式。国海燕[26]经过研究发现，褪黑素种子引发可以增加小麦的根冠比，提高地下部分的生长。袁志刚[27]以陆地棉的2个耐盐性较强和2个耐盐性较弱的品种为材料，研究褪黑素的引发处理对棉花种子萌发和出苗的影响。

种子的品种类型、原始生活力、处理剂量的多少、处理的时间和温度、种子含水量的多少和处理的方式方法等都是影响种子引发处理效果的重要因素[28]。引发后的种子，其活力提高、抗性增强、发芽迅速、出苗整齐、成苗率高[29]。

实验所研究的结果与以往文献论著相同点主要在于：所选取的试剂相对于水引发（对照）而言，对甜菜种子有明显的引发效果，且不同浓度或是不同处理时间的引发剂对于种子的萌发效果也各不相同。此外，本实验褪黑素所选取的不同浓度与前人研究所选取的浓度梯度基本保持一致；与前人所研究的不同之处除了所选取的褪黑素试剂在甜菜种子萌发领域的应用鲜有之外，主要的创新点在于为了测定在不同的引发剂浓度和不同的处理时间下甜菜种子活力的高低，为实验提供出更加精确的数值和指标。本实验增加了测定STm1619甜菜种子活力的电导率实验，且电导率实验的结果显示：不同浓度的褪黑素对于甜菜种子的萌发有显著的效果。

实验过程中，由于试剂称取质量的多少和试剂溶液损耗等情况会引起实验数据的部分误差。实验所选取的部分STm1619甜菜干种子不够饱满或是死亡，以上特殊情况对实验的最终数据和结果都会有些许影响。

本实验虽然经过仔细的设计和实践操作，但是仍会存在些许不足，主要的不足之处总结如下：（1）对于褪黑素引发剂而言，实验所选取的浓度梯度过少，可以进一步细化溶液的浓度和增加时间梯度的变化，这样能够寻找出更为适合褪黑素的浓度和处理时间；（2）本实验的限制因素除了实验中褪黑素质量的称取和溶液消耗等产生的误差外，还有所选取的种子出现死亡、培养箱水箱里的湿度和温度过高或者过低等因素；（3）因甜菜种子引发的研究仍处于初始阶段，引发剂组合、种类还在摸索阶段。因此，可以筛选出更多有利于甜菜种子萌发的引发剂种类和处理时间，从而为提高甜菜种子发芽率和块根产量和质量奠定一定的理论基础。

国内有关甜菜种子引发的研究极为少数。但随着甜菜育种近年来在中国东北部部分地区不断发展，我们更应该加强在选育甜菜种子抗病性以及引发活力等各方面的选育研究，使选取的甜菜种子更具有优良性。实验进行多种试剂引发研究从而可以筛选出更为适合甜菜种子引发的试剂，这样才能使实验结果更具备科学性和广泛性。此外，中国应该开括渠道，加强与国际相关引发研究的交流与联系，多途径引进更利于种子引发的资源，由种子引发理论到科学实践才能更好地展望种子引发的课题前景。

4 结论

本研究试验设置在温度为23℃、湿度为70%的条件之下，褪黑素浓度分别设置为50、100、200 μmol/L，处理时间分别为8、12、24 h。实验结果充分证明了在不同的处理时间内，不同浓度的褪黑素对甜菜种子发芽的影响会有很大的差异。实验设置的50、100、200 μmol/L三种不同梯度浓度处理，在8、12、24 h的处理时间之下，发芽势、发芽率和活力指数都比对照高，而50 μmol/L浓度的处理在12 h时的发芽率和活力指数数值均比其他的8个处理高；在200 μmol/L浓度、8 h的处理时间下，引发效果极为不明显，其发芽势、发芽率、发芽指数以及活力指数均与对照相近。总体看来，经过褪黑素引发剂处理过的STm1619甜菜种子，其发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数都高于对照。研究结果表明，褪黑素有利于甜菜种子的萌发，但是要择优选择出甜菜种子里，最适宜生长的褪黑素浓度和引发处理的时间梯度。