横断山脉亚高山高山栎根系可培养真菌的多样性研究

李鸿博，马 莉，黄耀华，康定旭，伍建榕，马焕成＊，陈 诗＊

(1.西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，西南林业大学 生物多样性保护学院，云南 昆明 650224)

高山栎(Quercusspp.)，高山常绿硬叶植物，形态分乔木和灌木型。高山栎作为横断山脉亚高山区域的典型植被和重要生态资源，其垂直分布跨度为900～4800 m，多集中于2400～3600 m之间[1]，水平分布特征为集中型森林分布和离散型散点分布，遍布整个横断山脉，作为优势种与建群种，构成了横断山脉亚高山地区特有的森林植被生态系统[2-4]。高山栎表现出对干旱和寒冷环境的高度适应性，对造林困难地段水土保持和生态恢复具有重要作用[5]。高山栎作为薪炭林，具极强的萌蘖更新能力，是理想的能源供应物质[6]。

真菌在土壤等自然环境中分布广泛，许多菌种可侵染植物根系并与其形成互惠共生的菌根。此外，近些年来研究发现暗色有隔真菌（DSE）是植物根系常见的内生菌，部分可与植物根系共生[7]，也有一些属于植物病原菌，侵染根系后可对植物生理代谢造成严重破坏[8]。因此，研究植物根系内生真菌的组成与多样性对进一步了解宿主植物生态适应性机制，以及筛选对植物生长发育有促进作用的内生真菌具有理论意义和实际应用价值。栎属植物根系能够与部分真菌形成外生菌根（ECM），形成后可提高土壤酶活，并为植物宿主提供水分、氮、磷等营养元素，增强宿主植物对干旱等逆境的抵抗力[9-10]。ECM在与宿主植物形成共生关系的过程中，与土壤中各种病原菌竞争生态位，并最终形成定殖。

我国西部滇、藏地区国家自然资源虽储备丰富，但高原生态环境脆弱，对其如何保护与治理已成为近年来生态文明建设的重要课题。选择高山栎作为研究对象，是因其长期适应高原寒、旱等恶劣生态环境，可以作为高原地区植被恢复的造林备选树种。杨淑娇等[11]发现高山栎林下菌塘同时存在外生菌根（ECMF）和从枝菌根真菌（AMF）。宋富强等[12]对川西亚高山带森林生态系统外生菌根的研究表明，该地高山栎0～20 cm与20～40 cm土壤中外生菌根侵染率与海拔高度呈显著正相关。目前，聚焦于高山栎根系菌根和益生真菌的研究仍较少。本研究以该地区3种典型高山栎根系为研究对象，通过对其根系内生真菌分离培养，结合形态学和分子生物学手段鉴定真菌，并对其多样性进行分析，以明确该地区高山栎根系内共生真菌的组成和分布区系，为阐明高山栎的生态适应机制提供理论依据，同时为筛选有益根系内生真菌提供活体菌种资源。

1 材料与方法

1.1 采样地概况

横断山脉纵贯我国西南部，纬度从25° N延伸至29°40′ N，北起西藏昌都，南至云南边境，总体呈北高南低趋势，是我国西南方地区的现代冰川分布区。该区域在27°40′ N以北垂直分带明显，气候变化分明，植被分布随海拔上升出现显著差异[13]。横断山脉亚高山带林木一直以来虽受到较好保护，但其生态环境整体脆弱，高原生态系统不稳定，且时刻面临高山冰川消融等威胁，区域内部分地区水土流失较为严重[14]。

1.2 样品采集

于2020年7月、10月分别从横断山脉亚高山 地 区28°45′3″～30°59′35″N,97°40′25″～102°50′18″E间的不同海拔（2610～3480 m）地区阳坡地段高山栎林下拉设10 m×10 m样方，于样方内高山栎（Q. semicarpifoliaSmith）、长穗高山栎（Q. longispica(Hand.-Mazz.) A.Camus）及川滇高山栎（Q. aquifolioidesRehd.et Wils.）根部0～40 cm土层沿主根采集侧根至根尖，每种树选取3棵（3株长穗高山栎均编号GSL2）（表1）。根系样品分两部分，清理并分别标记，一份用干燥储藏管存于含冰袋的保温箱带回，-4 ℃保存；另一份放入FAA固定液（用时稀释一倍）保存，备后续试验。

表1 横断山脉亚高山高山栎样地概况Table 1 Brief information of Quercus sampling plots in Hengduan Mountains

1.3 试验方法

1.3.1 高山栎根系内真菌侵染情况观察 为观察根系内潜在的AMF、DSE或其他真菌等，取去除根尖的次生根系样本，经清水反复冲洗3～5次后剪成0.5 cm的小段。将组织小段分别放入10%KOH溶液中，90 ℃水浴1.5 h，取出重复涮洗，浸入3%乳酸溶液脱色10 min。再次涮洗，并加入0.05%苯胺蓝溶液，90 ℃水浴2 h，重复涮洗脱色，至根系颜色半透明或透明，取脱色较好的根系制片观察并记录侵染状况[15]。

1.3.2 共生真菌的分离与纯化 流水冲洗根系样本12 h后，取待用根系裁成0.5 cm小段。分别以70% 酒精和0.1%升汞溶液消毒10 s和1 min，以五点培养法置于PDA和MA平板上，倒置后于25 ℃培养7～14 d[16]。根系组织块上长出真菌菌落后进行真菌转接培养和纯化，并保存菌株，经PDA和MA平板标准培养后进行形态学与分子学鉴定。

1.3.3 共生真菌的形态学鉴定 盖玻片灭菌后呈45°斜插入菌落边缘，置于25 ℃恒温培养箱中培养14 d，制片并在LEICA MD750显微镜下观察形态。查阅相关真菌分类书籍与文献[17-18]，进行形态学鉴定。

1.3.4 共生真菌的分子生物学鉴定 利用改良的DNA快速提取法[19]，提取菌体基因组DNA。选用ITS1、ITS4[20]通用引物进行PCR扩增检测真菌DNA。PCR反应体系为50 μL(ddH2O 20 μL，TaqPCR Master Mix 25 μL，ITS1 1.5 μL，ITS4 1.5 μL，DNA 2 μL)。94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s。回收PCR产物经凝胶成像系统（Molecular Imager GEL Doc TM XR）检测。将条带清晰的产物送生物公司（TSINGKE昆明）进行测序。

1.3.5 共生真菌多样性数据分析 α多样性是指以一种或几种多样性指数来测度和描述某一均质群落或生境内个体数在物种总数上的分配状况[21]。本研究选取Shannon-Wiener、Simpson多样性指数和Margalef 丰富度指数作为判断所分离菌落的物种多样性指标，以丰富度和均匀度相互补充说明菌种多样性。以上述3种高山栎根系样本作为各真菌种类生存的生境，分离真菌总数作为高山栎根系内可被分离的真菌总载量，各项指数数值越大，意味着该菌种的多样性越丰富。采用EXCEL2003 Biodiv统计CFU(菌落形成单位)分离频率等指标。经Chromas2.22和DNAMAN8软件对目标真菌种类的序列进行峰图查验与序列拼接处理后，提交至NCBI利用BLAST多重对比，以相似度为97%为基准确定属种分类关系。

2 结果与分析

2.1 高山栎根系内生菌侵染观察

将染、脱色处理的根系制片后在显微镜下观察形态，可见根细胞内菌丝、微菌核以及暗色有隔真菌（DSE）等形态结构，观测到DSE在根系表皮部的侵入位点。菌丝直径6.2～15.8 μm，微菌核直径19.3～46.7 μm（图1-A至1-I）。根据菌丝在高山栎根系的侵染点和形态特征，初步判断有2种以上DSE。另外，在高山栎根皮层细胞内观察到大量疑似AM泡囊结构（图1-J、1-L），判断其为高山栎菌根结构。该类结构在3种高山栎根皮层细胞中均可发现，但以长穗高山栎居多，其他两种高山栎较少。

图1 3种高山栎根系中的真菌侵染结构Fig.1 Fungal colonization and structures in roots cortex of Quercus spp.

2.2 高山栎共生真菌的形态多样性

显微观测发现3种高山栎根皮层细胞中均存在DSE和AM等真菌结构。对3种高山栎根系内生真菌分离培养，共获得519株真菌，从高山栎、长穗高山栎、川滇高山栎的根系中分别分离得到174株、163株、182株，经形态鉴定，共27种真菌。从种类数量上看，高山栎根系内生真菌具有明显的形态多样性[21]，而且在菌落形态、颜色、生长速度、表面分泌物、菌落质地及产孢（表2）（图2）等方面存在较大差异。

图2 从高山栎根系分离真菌的菌落及显微形态结构Fig.2 The colonies and microscopic structures of fungi isolated from three speices of alpine Quercus

表2 从3种高山栎根系中分离获得的各真菌菌株的菌落特征Table 2 Morphology characteristics of fungal colonies isolated from three species of Quercus

2.3 高山栎根系内生真菌的分子鉴定

对各内生真菌菌株的ITS区段序列扩增获得长度500 bp左右的序列。在NCBI的GenBank中比对分析表明，除GSL1-7(96.96%)和GSL3-1(95.75%)可鉴定至科和属，其余菌株与GenBank中的同源菌株相似度均高于97%[22-23]，可鉴定至种水平。通过对获得的各菌株ITS rRNA gene序列比对分析，共鉴定出17科20属27种真菌。文献记载表明包括4种DSE，2种有益菌或生防菌,以及部分病原菌(表3)。

表3 横断山脉高山栎根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比对结果Table 3 Blasting comparison results for rDNA ITS sequences of root endophytic fungi from three species of Quercus in Hengduan Mountains

2.4 高山栎根系定殖真菌物种多样性指数

通过对3种高山栎根系内生真菌物种多样性和丰度分析发现，其多样性丰度表现为高山栎＞长穗高山栎＞川滇高山栎。从真菌种类来看，Trichoderma tomentosum（绿色木霉）的分离频率最高（7.13%），在3种高山栎根系中均可分离到，其次为Fusarium acuminatum、Phoma herbarum(DSE) 和Trichocladium opacum。另3种DSE如Boeremiaexiguavar.exigua、Phialophora mustea、Paraboeremia putaminum分离频率分别为3.47%、6.74%和5.20%；Pseudogymnoascus roseus的分离频率为4.05%，有文献报道该菌对植物生长有促进作用。Mucor nederlandicus分离频率最低（0.96%），仅分离自高山栎根系。经对3种高山栎根系内生真菌多样性指数分析，发现Shannon指数明显大于1，Simpson指数均接近于1，说明3种高山栎根系内生真菌物种多样性较丰富，但3种高山栎间根内真菌多样性无显著差异（表4）。

表4 3种高山栎根内生真菌的α多样性指数Table 4 α diversity indices of endophytic fungal species of three alpine species of Quercus

3 讨论

对横断山脉亚高山带3种高山栎根系内生真菌分离培养共获得519株真菌，鉴定出真菌17科20属27种。根系染色结果表明，3种高山栎根皮层内均存在内生真菌，可见包括菌丝、微菌核及疑似AMF的泡囊结构。3种高山栎根内真菌α多样性分析发现内生真菌物种多样性较丰富，其中包含较多有益真菌或生防菌。

本研究分离鉴定出的27种真菌中，Ceratobasidiaceae科真菌（GSL1-7）为外生菌根菌[24]，其与NCBI中已知菌株序列相似度低于97%，说明该菌种为尚未被描述。Boeremia exiguavar.exigua、Phoma herbarum、Phialophora mustea及Paraboeremia putaminum为DSE。Pseudogymnoascus roseus、Trichocladium opacum、Thelonectria veuillotiana及Mucor nederlandicus曾在采自川、滇、藏等地的虫草菌核中分离得到，其中P. roseus能够促进植物生长并抑制病害[25-26]。绿色木霉Trichoderma tomentosum为土壤习居菌，可用于植物病害生物防治[16,26]。

Plectania rhytidia和Ilyonectria crassa曾在2种西藏药用植物根系中分离得到[27]，此次从高山栎根系分离获得，说明2者在横断山区分布广泛，但其对宿主植物的作用尚不明确。Kehr[28]报道Pezicula cinnamomea可侵染美国红栎而造成严重损失。Kwaśna等[29]研究从洪水浸泡后的罗布栎(Quercus robur)分离出Pezicula radicicola，故推测这两种真菌对高山栎具有潜在致病性。此外，Cladosporium cladosporioides、 Dactylonectria estremocensis、D. torresensis、Pestalotiopsis kenyana、Fusarium acuminatum、F. redolens、Thelonectria veuillotiana及Ilyonectria robusta等为潜在的病原菌[30-31]。近年来，不断有研究报道，DSE是植物根的常见内生菌[29]，且在促进植物生长、改善植物矿质营养、调节植物内源激素平衡、增强植物耐重金属离子和抗环境污染等方面意义重大[32-33]。DSE普遍存在于高山栎根系内，具有某种生理和生态功能，以提升高山栎的抗逆适应能力。

高山栎是横断山脉亚高山的优势树种，具有重要的生态价值。但本研究中乔木和灌木型高山栎根系木质化程度均较高，不利于菌种回接。由于本研究取样范围和数量有限，只获得了初步研究结果，因此，对该地区不同海拔分布的高山栎根系内生真菌种类和功能仍有待进一步深入研究。

4 结论

本研究通过组织显微观察，发现横断山脉亚高山3种高山栎的根皮层细胞内有菌丝、微菌核、泡囊等结构，反映出其根系普遍存在DSE等内生真菌。从横断山脉亚高山3种高山栎根系中分离鉴定出3门17科20属27种内生真菌，表明横断山脉亚高山3种高山栎根内真菌物种多样性丰富，存在菌根菌、DSE和木霉等内生真菌及部分潜在的病原菌。初步研究发现3种高山栎根系内生真菌的多样性丰度差异不显著。