基于液相色谱-串联质谱法的动物源性食品中33种农药及其代谢物的测定

李蔚然 郑 锌 汤晓艳

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量标准研究中心，北京 100081；2.岛津企业管理（中国）有限公司，北京 100020）

动物源性食品中存在六六六、滴滴涕[1]、溴氰菊酯、氰戊菊酯[2]、氟虫腈[3]等多种农药残留问题，该情况已得到政府的高度重视。2019年，我国颁布的GB2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》就针对动物源性食品中703项农药残留限量进行了规定，这标志着我国农药残留监管从植物源性食品拓展到动物源性食品[4]。目前，最新颁布的2021版GB 2763标准[5]已经对动物源性食品中903种农药残留限量进行了规定。此外，GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[6]也对部分养殖环境用杀虫剂在动物源性食品中的残留限量进行了规定。然而，GB 2763-2021与GB 31650-2019标准规定的氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、二嗪磷等19项限量指标存在不一致的问题。同时，我国GB 2763-2021标准中涉及的动物源食品中农药残留限量与国际食品法典委员会（CAC）相应标准也存在规定不一致的问题，共涉及有77项指标。在GB 2763-2021标准中，动物源性食品中农药残留配套检测方法标准共涉及30项，但存在标准年限久、检测方法操作复杂、检出限高于限量值等问题。

为了对GB 2763-2021与GB 31650-2019标准和CAC标准的不一致问题进行评估，本研究拟建立GB 2763-2021标准中33种农药及10种代谢物的基于QuEChERS前处理的LC-MS/MS检测方法，并将方法应用于检测居民日常消费的肉类、内脏、蛋类、生乳等大宗动物源性食品进行方法验证，以期为我国动物源食品中农药残留限量标准再评估提供方法支撑。

一、材料与方法

（一）仪器、试剂与材料LC-MS 8045三重四极杆液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）；Eclipse XDB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美国安捷伦公司）；电子分析天平（感量0.01 g和0.000 1 g，上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；Milli-Q去离子水发生器（美国密理博公司）；多管旋涡混合仪（江苏恒敏仪器制造有限公司）；台式高速冷冻离心机（北京天林恒泰科技有限公司）；氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）。

乙腈（色谱纯，德国默克公司）；QuEChERS萃取盐包［4 g无水硫酸镁（MgSO4）、1 g氯化钠（NaCl）、1 g柠檬酸钠（TSCD）、0.5 g柠檬酸氢二钠（DHS），苏州纳谱分析技术有限公司］；无水硫酸镁（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；十八烷基硅烷（C18，苏州赛分科技有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；石墨化碳黑（GCB，美国Dikma公司）；38种农药混合标准溶液（10 mg/L），多杀霉素A、多杀霉素D、氟啶虫胺腈、5-羟基噻菌灵、杀线威标准溶液（100 mg/L），均购于天津阿尔塔科技有限公司。

（二）标准溶液的配制将38种农药混合标准溶液和5种农药标准溶液用乙腈稀释成1 mg/L的混合标准储备液，于-20℃避光保存，有效期为1个月。

（三）样品采集与制备

1.样品采集。共采集238份来源于农贸市场、养殖场和屠宰场的样品。采样地点涉及北京、江苏、内蒙古、甘肃、山东、河南、上海、四川、广东、江西10个省（自治区、直辖市）。样品具体包括猪肉36份、牛肉27份、羊肉17份、猪肝27份、鸡肉41份、鸡蛋40份、生乳50份。样品采集后贮藏于-20℃，尽快送至实验室。

2.样品制备。肉类和内脏切块后，用绞碎机充分绞碎均匀成糜状；蛋类去壳后用搅拌机搅匀，制成匀浆；生乳混匀，置于-20℃条件保存备用。

（四）试验方法

1.色谱条件。色谱柱为Eclipse XDB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱温为40℃；流动相A为含0.01%甲酸的2 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇；流速为0.3 mL/min；进样量为5.0 μL；溶剂共进为前后分别注入15 μL；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子和负离子同时扫描；检测方式为多反应离子检测模式（MRM）；雾化气流量为3 L/min；干燥气流量为10 L/min；加热气流量为10 L/min；接口温度为300℃；脱溶剂温度为526℃；脱溶剂管（DL）温度为150℃；加热块温度为400℃；碰撞诱导解离（CID）气为高纯氩气（纯度99.999%），CID气压力为230 kPa；43种目标物的离子对及碰撞能量参数见表2。

表2 43种目标物的保留时间、离子对及碰撞能量

3.样品提取。准确称取样品5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯离心管中。肉类、内脏、蛋类样品先加入2 mL水，后加入10 mL乙腈提取；生乳样品不加水直接加10 mL乙腈提取，用力混匀，涡旋振荡1 min。之后加入QuEChERS萃取盐包，迅速用力摇匀，涡旋振荡1 min，在4℃条件下以10 000 r/min离心5 min后待净化。

4.样品净化。取上清液3 mL转移至预先称好净化剂（450 mg无水MgSO4、50 mg C18和50 mg PSA）的15 mL离心管中，涡旋振荡1 min，在4℃条件下以10 000 r/min离心5 min。

5.氮吹定容。取2 mL上清液于离心管中进行氮吹，氮吹至1 mL，加水定容至2 mL，过0.22 μm有机相滤膜至进样小瓶，待上机测定。

二、结果与分析

（一）流动相的选择本研究比较了水-乙腈和水-甲醇分别作流动相对目标物分离和响应效果的影响。结果显示，在水-乙腈条件下，联苯菊酯和敌敌畏的响应值低，而在水-甲醇条件下，响应值明显提高，因此，有机相选择甲醇。甲酸可提高[M+H]+离子的响应强度，乙酸铵能够提高[M-H]-离子的响应强度以及改善峰形[7]，因此考察水相中添加不同浓度的甲酸（0.01%、0.05%、0.1%）、乙酸铵（2、5 mmol/L）对峰形、响应值、保留时间的影响。经考察比较，最终确定流动相的条件为含0.01%甲酸的2 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇，在此条件下，目标物的响应值高、峰形好，且能确保目标物基本在杂质洗脱前出峰。

（二）提取条件的选择43种目标物的极性差异大（极性排序见图1），因此选择的提取剂应具有较强的提取能力。另外，动物源性食品含有丰富的蛋白质、脂肪等营养成分，共提物对目标物信号产生干扰，因此应选择提取杂质少的提取剂。已有研究中考察了乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷-丙酮等提取剂的提取效率，结果显示，当乙腈为提取剂时，提取效率普遍更高、杂质提取量更少[1，8]。因此，基于现有研究结果，本研究选择乙腈为提取剂。肉类、内脏、蛋类样品具有一定的黏性，且有研究表明，乙腈会导致蛋白质快速变性沉淀，造成目标物因包裹难以释放[9]，因此需加水使样品分散得更加均匀，增强乙腈对样品的渗透性以及对农药的提取效果[10]。

图1 43种目标物极性强度排序

本研究以猪肉为基质，考察了在10 mL乙腈中添加不同水量（0、2、5 mL）对目标物提取效率的影响，结果表明，加入适量的水可以使猪肉样品更均匀地分散在液体体系中，避免成大块团状，但加水量2 mL和5 mL对回收率没有显著差异，考虑到后续盐析步骤中无水MgSO4、NaCl的用量，因此选择2 mL水+10 mL乙腈进行匀浆提取。

（三）净化剂的选择动物源性食品中的脂肪、蛋白质、维生素等杂质会干扰目标物的离子化效率及响应强度，同时各种杂质在色谱柱、仪器管路中的残留堆积容易造成色谱柱和仪器堵塞，导致灵敏度下降，因此需要对提取液进行净化。常用的QuEChERS净化材料包括C18、PSA、GCB。C18对脂肪等非极性物质有较高的容量；PSA可以去除食品基质中的糖类、有机酸、脂肪酸等多种组分；GCB可用于去除样品中的色素、甾醇等杂质[1，11～12]。

本研究以猪肉为对象，考察了QuEChERS方法中PSA、C18、GCB不同用量对目标物回收率的影响，考察条件分别为450 mg无水MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18、450 mg无水MgSO4+100 mg PSA+100 mg C18、450 mg无水MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18+25 mg GCB，结果见表3。根据结果最终选择加入450 mg无水MgSO4+50 mg PSA+50 mg C18进行净化。

表3 不同净化条件下43种目标物的回收率分布

（四）溶剂效应取净化液直接上机测定，结果显示，5-羟基噻菌灵、杀线威肟、霜霉威等极性较大、出峰较早的目标物的峰型因溶剂效应而存在展宽、分叉的现象，因此，需对上机溶液进行调整。考察上机溶剂为乙腈、50%乙腈水（V乙腈∶V水＝1∶1）、33%乙腈水（V乙腈∶V水＝1∶2）对峰型的影响，结果表明，当上机溶剂为50%乙腈水时，溶剂效应即可得到改善。

（五）方法学验证

1.基质效应。基质效应（ME，%）采用基质匹配标准溶液的标准曲线斜率与溶剂标准溶液的标准曲线斜率的比值进行评价，计算公式为ME＝（b基质/b溶剂）×100。当ME＞100%时，表现为基质增强效应；当ME＜100%时，表现为基质抑制效应；且当ME介于80%～120%之间时，通常认为不存在明显的基质增强或基质抑制效应，当超出此范围时表明存在较强基质效应，须进行基质效应补偿[13～14]。

4类动物源性食品中43种目标物的基质效应结果见图2。如图2所示，部分目标物存在明显的基质效应。减少基质效应影响的方法包括使用同位素标记法、基质匹配标准溶液、分析物保护剂等[1]，本方法采用基质匹配标准溶液进行测定，以削弱基质效应的影响。

图2 43种目标物在4类动物源性食品中的基质效应

2.线性关系与检出限。按前处理方法得到基质溶液。用基质溶液配 制浓 度为1、2、5、10、50、100 μg/L的基质标准溶液，以目标物的峰面积和质量浓度分别为纵坐标（Y）和横坐标（X）进行线性回归分析。结果表明，除敌敌畏在2～100 μg/L浓度范围内线性良好，其余目标物均在1～100 μg/L浓度范围内呈良好线性关系，相关系数（r）介于0.996 8～0.999 9之间（见表4～表7）。

根据化合物响应情况，以定量离子信噪比（S/N）＝3估算检出限（LOD），得到43种目标物的LOD为0.02～3.34 μg/kg（见表4～表7）。

3.回收率、精密度与定量限。称样后，分别加入5、20、100 μg/kg的43种目标物混合标准溶液，按上文确定的试验方法进行处理、测定，每个添加回收水平重复5次。定量限（LOQ）为满足要求的回收率和相对标准偏差（RSD）对应的最低浓度。结果显示，43种目标物在肉类、内脏、蛋类、生乳中的回收率范围为60.7%～120.0%，RSD为0.2%～19.6%（见表4～表7），方法的LOQ为5 μg/kg，均满足限量要求和NY/T 788-2018《农作物中农药残留试验准则》要求。

表4 肉类中43种目标物的线性关系、相关系数、检出限、回收率及精密度

表7 生乳中43种目标物的线性关系、相关系数、检出限、回收率及精密度

表5 内脏中43种目标物的线性关系、相关系数、检出限、回收率及精密度

表6 蛋类中43种目标物的线性关系、相关系数、检出限、回收率及精密度

（六）实际样品检测分析利用上述建立的方法对猪肉、猪肝、鸡肉、鸡蛋、生乳等238份动物源性食品中43种目标物进行检测，检出结果见表8。由表8可知，鸡蛋样品中农药的检出率最高，为20.00%，其中2份检出毒死蜱，1份检出氟甲腈，3份检出氟虫腈砜，还有2份样品同时存在氟虫腈砜和杀线威残留。此外，在生乳、牛肉和羊肉中也检出农药残留，其中各有2份生乳样品分别检出氟啶虫胺腈和啶虫脒；1份牛肉样品和2份羊肉样品检出吡唑醚菌酯。鸡蛋中杀线威、生乳中氟啶虫胺腈和啶虫脒以及牛羊肉中吡唑醚菌酯虽有检出，但存在低于LOQ的情况。依据GB 2763-2021标准规定，238份动物源性食品中农药残留水平均低于最大残留限量（MRL）。

表8 实际样品检出结果

结合其他文献的检出结果进行分析，可以发现氟虫腈在鸡蛋中的残留概率相对其他种类农药和动物源性食品来说较高，在本次样品中以氟虫腈砜残留为主（1/6为氟甲腈、5/6氟虫腈砜），该结果也与现有文献结果相同[15～19]。还有检测结果表明，我国鸡蛋中的氟虫腈残留水平存在超标的情况。XU等[17]在来源于成都当地超市及农场的48份鸡蛋样品中，检出1份氟虫腈残留水平达313.2 μg/kg的样品，该数值明显超标。因此，氟虫腈作为卫生杀虫剂使用时应注意使用方式，以降低残留的发生概率和残留水平。另外，黄小波和刘维平[20]在鸡蛋中有检出毒死蜱残留。目前虽没有相同检测结果表明生乳中存在啶虫脒残留，但有在鸡蛋和动物粪便中检出啶虫脒残留的文献报道[20～22]。本研究中，氟啶虫胺腈、啶虫脒、毒死蜱等农药在动物源性食品中的残留可能是由于畜禽食用了有农药残留的饲料或采食了受农药污染的食物，也可能是由于农药在施用后污染了畜禽的生活环境。

三、结论

本研究通过对流动相及前处理条件的优化，建立了动物源性食品中33种农药及10种代谢物的QuEChERS-LC-MS/MS方法，方法检出限为0.02～3.34 μg/kg，定量限为5 μg/kg，43种目标物的回收率在60.7%～120.0%之间。该方法适用基质范围广，能满足监管过程中的相应农药残留的定性定量检测要求，可为动物源性食品日常检测和限量再评估提供方法支撑。

本文引用格式：李蔚然，郑锌，汤晓艳.基于液相色谱-串联质谱法的动物源性食品中33种农药及其代谢物的测定 ［J］.农产品质量与安全，2022（6）：5-14.

LI Weiran，ZHENG Xin，TANG Xiaoyan.Determination of 33 pesticides and their metabolites residue in animal-derived foods by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Quality and Safety of Agro-products，2022（6）：5-14.

atographyA，2019，1593：81-90.