高密度CO2溶解和扩散方式对虾肉糜凝胶品质的影响

孙钦秀,董安迪,侯倩,王宇晗,郑欧阳,魏帅,夏秋瑜,韩宗元,王泽富,吉宏武,刘书成*

1(广东海洋大学 食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋生物制品工程实验室,广东省海洋食品工程技术研究中心,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东 湛江,524088)2(海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心(大连工业大学),辽宁 大连,116034)

鱼糜制品是一种富含蛋白质的海洋食品，因其营养丰富、口感风味好、产品形式多样而深受消费者喜爱[1]。然而，在传统热加工过程中鱼糜产品常发生出油、出水、结构松散等质量问题，影响产品品质和经济效益[2]。已有研究表明高密度CO2技术可以有效改善蛋白质的凝胶特性，是一种可以补充或替代传统热加工的新加工技术[3-6]。本课题组在前期研究中也发现利用高密度CO2诱导虾肉糜(鱼糜的一种)形成凝胶，其感官品质、凝胶强度、微观结构和营养成分等方面均优于热加工虾肉糜凝胶[5, 7]。因此，高密度CO2处理有望成为加工鱼糜凝胶制品的新技术手段。但是在前期研究中本团队发现，高密度CO2在虾肉糜中的溶解和扩散方式对于虾肉糜形成凝胶的过程也有重要影响。然而其相关研究尚缺乏详实的数据支持。

为了考察高密度CO2溶解和扩散方式对虾肉糜凝胶强度的影响，本研究采用自制的溶解和扩散模具(纵向、横向和混合)，以热诱导虾肉糜凝胶为对照，研究了高密度CO2在纵向、横向和混合等3种溶解和扩散方式下制备的虾肉糜凝胶的品质特性(主要营养成分、感官品质、保水性、凝胶强度、水分分布、微观结构等)，为研究高密度CO2溶解和扩散行为与凝胶特性之间的关系提供基础数据，同时为选择合适的高密度CO2处理方式制备鱼糜制品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：凡纳滨对虾(Liopenaeusvannamei)，规格36～40只/kg，购于广东省湛江市霞山东风水产批发市场，加冰充氧保活运送至实验室。用自来水清洗后，选取大小均一、形体完整的虾。

试剂:碘盐,市售;二氧化碳(纯度99.99%),湛江氧气厂;戊二醛、磷酸、乙醇、叔丁醇、醋酸异戊酯、硫酸、盐酸、硫酸钾、硫酸铜等(均为分析纯),湛江市科诚贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

HA221-50-10-C型超临界装置,南通市华安超临界萃取有限公司;HH-8数显恒温水浴箱,常州澳华仪器有限公司;TMS-Pro型物性分析质构仪,美国FTC公司;CR22GⅡ型高速冷冻离心机,日本日立公司;HYP-Ⅱ马弗炉,上海纤检仪器有限公司;TCP-B全自动测色色差仪,北京奥依克光电仪器有限公司;MeaseMR23-060 H-1低场核磁共振成像分析仪,苏州钮迈仪器有限公司;Sirion200型场发射扫描电子显微镜,荷兰飞利浦FEI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 虾肉糜的制备

鲜活对虾经过去头、壳、肠腺后,虾肉用剪刀剪碎,用于虾肉质量5倍的冰水反复漂洗3次(15 min/次),然后用2层纱布对肉糜进行挤压脱水,再加入3%(质量分数)的食盐,在冰水浴中擂溃15 min,即制成虾肉糜样品[水分70%(质量分数)左右],待用于制备凝胶。

1.3.2 热诱导制备虾肉糜凝胶

将制备的虾肉糜充填入混合溶解和扩散的模具中,40 ℃水浴加热15 min,90 ℃水浴加热30 min,迅速冷却至室温,制备好的虾肉糜凝胶在4 ℃冰箱中放置24 h后用于测试品质指标。

1.3.3 高密度CO2诱导虾肉糜制备凝胶

图1是高密度CO2处理装备示意图。试验开始时,首先打开制冷及制冷循环,设置处理釜所需温度,然后将虾肉糜样品放入处理釜中,密封,开启高压泵泵入CO2气体,待压强上升至所需压强,关闭高压泵,封闭进出处理釜的阀门,维持处理釜内所需的压强和温度,静态处理一段时间后,卸压取出样品。处理好的样品要迅速冷却,在4 ℃放置24 h后用于测试品质指标。

高密度CO2纵向溶解和扩散处理的参数为:压强30 MPa、温度60 ℃、时间60 min;高密度CO2横向溶解和扩散的参数为:压强30 MPa、温度60 ℃、时间60 min;高密度CO2混合溶解和扩散的参数为:压强30 MPa、温度55 ℃、时间60 min。

图1 高密度CO2处理流程Fig.1 Process of dense phase carbon dioxide

1.3.4 主要营养成分的测定

水分的测定采用恒温烘箱干燥法(GB 5009.3— 2016);粗蛋白的测定采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2016);灰分的测定采用高温灼烧法(GB/T 5009.4—2016)。

1.3.5 感官评定

感官评定参考周蕊等[8]的方法稍作改动。感官评定小组由7名训练有素的评价员组成。评定人员根据表1的标准,对样品进行感官评定。评定指标包括气味、色泽、组织形态和滋味。每一项的分值范围1～5分,每一项权重为气味0.1、色泽0.1、组织状态0.5和滋味0.3。评分越高,品质越好。总体得分计算公式为:总分=∑aibi(i=1,2,3...n)(a为评定指标,b为评定权重)。评分结果以7位评价员所得数据的平均值±标准差表示。

表1 虾肉糜凝胶的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of shrimp surimi gel

1.3.6 凝胶强度的测定

凝胶强度的测定参考刘书成等[5]的方法。将制备好的虾肉糜凝胶,用TMS-PRO型质构仪联合P/0.5 cm(直径)柱形探头测定破断强度和破断距离。测试速度为1 mm/s,穿刺深度为10 mm,起始力1.5 N,样品高度20 mm。凝胶强度的计算如公式(1)所示:

凝胶强度/(N·mm)=破断强度(N)×破断距离(mm)

(1)

1.3.7 保水性的测定

虾肉糜保水性的测定参顾赛麒等[9]的方法测定。称取虾肉糜凝胶样品质量ω1(g),用3层滤纸包裹后置于离心管中在8 000×g下离心10 min,离心后称取虾肉糜凝胶样品质量为ω2(g),保水性计算如公式(2)所示:

(2)

1.3.8 水分分布状态的测定

虾肉糜水分分布状态的测定参考SUN等[10]的方法，采用低场核磁共振仪测定。质子共振频率为21 MHz，磁体强度为0.43 T，采用Caar-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列对样品进行扫描，得到横向弛豫时间T2，将迭代次数设置为105，并将获得的曲线反演为T2和振幅相对面积A2。

1.3.9 微观结构的测定

电镜扫描参考FENG等[11]的方法。将虾肉糜凝胶样品切成规格2 mm×2 mm×5 mm小块,在4 ℃条件下,放入2.5%(体积分数)的戊二醛溶液中固定12 h,然后用0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)清洗固定后的样品3次,每次10 min。吸出缓冲液,加入乙醇逐级梯度脱水,脱水剂的乙醇体积分数依次为30%、50%、70%、90%、100%的乙醇2次,每次脱水10～15 min。吸出乙醇,加入醋酸异戊酯与乙醇体积比1∶1的混合液,浸泡10～20 min并适当摇动。用100%叔丁醇置换1次,时间15 min。样品真空冷冻干燥;喷金,用扫描电镜观察,放大倍数×1 500。

1.3.10 数据处理

每个试验重复3次,数据用平均值±标准差表示,采用JMP10.0统计软件进行方差分析和Tukey′s HSD多重比较分析,置信度为95%(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 虾肉糜凝胶的主要营养成分

由表2可以看出,与未处理的虾肉糜相比,热诱导和高密度CO2诱导制备虾肉糜凝胶的水分和蛋白质都有所损失(P<0.05),热诱导虾肉糜凝胶的灰分损失比较大(P<0.05),高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶的灰分基本无损失(P>0.05)。与热诱导的虾肉糜凝胶相比,高密度CO2诱导虾肉糜凝胶的水分和蛋白质损失较少(P<0.05),高密度CO2纵向、横向和混合溶解和扩散诱导的虾肉糜凝胶的主要营养成分之间无显著差异(P>0.05)。

表2 虾肉糜凝胶的主要营养成分 单位：%

虾肉糜形成凝胶的过程是虾肉肌原纤维蛋白在热或高密度CO2诱导下先慢慢变性,再进行适当的交联和聚集,而形成有序的三维网状结构,生成具有较高强度和弹性的凝胶体[6-7]。在这个过程中,由于蛋白质变性而暴露出疏水基团以及肌原纤维蛋白收缩等原因而使肉糜持水力下降[12],导致水分含量显著下降。

热诱导制备虾肉糜凝胶是利用水煮的方式,在水煮的过程中部分水溶性蛋白和矿物质可能溶于水中,而使凝胶中的蛋白质和矿物质有所损失;高密度CO2制备虾肉糜凝胶是在无水的CO2环境中进行,虽然高密度CO2对水分有一定的萃取作用[13],但对蛋白质和矿物质不具有萃取作用,而且这个过程是静态处理,仅仅在卸压过程中可能有少量水溶性蛋白和矿物质被水分携带出来[5],而使凝胶中的蛋白质有少量损失,矿物质基本无损失。

2.2 虾肉糜凝胶的感官评分

对虾肉糜凝胶主要从气味、色泽、组织形态和滋味等4个方面进行感官评价(图2)。新鲜未处理的虾肉糜呈青灰色,具有生虾应有气味和滋味,既黏稠又松软,不能成型。热诱导虾肉糜形成的凝胶,呈现红色,具有一定熟虾的香味和滋味,凝胶成型较好,具有一定的弹性,但组织疏松且具有较多的不均匀气孔。高密度CO2诱导虾肉糜形成的凝胶,呈现鲜亮的红色,具有熟虾的香味和滋味,凝胶成型好,具有较好的弹性,而且组织致密均匀。

由图3可以看出,热诱导虾肉糜凝胶的感官评分显著高于未处理的虾肉糜(P<0.05)。高密度CO2诱导虾肉糜凝胶的感官评分又显著高于热诱导的感官评分(P<0.05)。热诱导可以使蛋白质发生变性使虾青素被释放出来而呈现红色;但热诱导是在水浴中进行,容易损失较多的气味和滋味物质。另外,热诱导的传热速度慢和传质不均匀也导致凝胶的组织结构较疏松。高密度CO2诱导是在无水环境中进行,滋味物质损失较少;虽然高密度CO2对挥发性气味物质具有萃取作用,但是高密度CO2处理是静态处理,仅仅在卸压的过程中有少量损失;由于高密度CO2也能使蛋白质充分变性,从而使虾肉糜凝胶呈现出鲜亮的粉红色。另外,CO2在超临界状态下的表面张力为零,使其在虾肉糜中的溶解和扩散比较均匀,从而形成了组织结构比较均匀和致密的凝胶形态。高密度CO2三种溶解和扩散方式诱导制备的虾肉糜凝胶,在感官评分上并无显著差异(P> 0.05),这是因为3种高密度CO2处理的参数(压强、温度和时间)均能使虾肉糜充分形成凝胶。

图2 虾肉糜凝胶的外观图Fig.2 The appearance of shrimp surimi gel

图3 虾肉糜凝胶的感官评分Fig.3 Sensory evaluation of shrimp surimi gel注:不同小写字母表示有显著差异(P<0.05)(下同)

2.3 虾肉糜凝胶的强度

凝胶强度是鱼糜制品非常重要的品质评价指标。一般来说，凝胶强度越大，鱼糜制品的品质越好[14]。由图4可以看出，未处理虾肉糜的凝胶强度未测出，因为生虾肉糜组织松软，无法成型。高密度CO2诱导虾肉糜凝胶的强度显著高于热诱导(P<0.05)。热诱导鱼糜形成凝胶的过程包括凝胶化、凝胶劣化和鱼糕化3个阶段，凝胶化和鱼糕化有助于提高鱼糜制品的凝胶强度，而凝胶劣化则降低鱼糜制品的凝胶强度[15]。鱼糜凝胶劣化是指鱼肉中存在的耐热的碱性蛋白酶在50～70 ℃使肌原纤维蛋白(特别是肌球蛋白)发生降解，大大降低了凝胶的弹性和强度[16]。研究表明，高密度CO2处理对诱导鱼糜凝胶劣化的碱性蛋白酶具有很好的钝化作用[17]，从而抑制鱼糜的凝胶劣变。此外，高密度CO2也能诱导食品蛋白质变性和聚集并发生交联形成凝胶。高密度CO2诱导蛋白质形成凝胶的机制主要有以下三点：(1)高压下CO2的分子效应[18]。CO2本身是疏水溶剂，可以与蛋白质的氨基酸残基的疏水侧链发生相互作用，使其疏水基团暴露，改变蛋白质周围的水环境，使蛋白质构象发生变化，导致蛋白质变性和聚集。或者，高密度CO2与蛋白质的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)残基结合形成复合物，导致蛋白质变性和聚集；(2)pH值降低效应[18]。高压下CO2溶于水生成H2CO3，又解离出H+降低体系的pH值。一方面不耐酸或接近等电点的蛋白质由此而变性聚集；另一方面，H+会使蛋白质带上大量的正电荷，使整个蛋白质内部表现出静电斥力，蛋白质高级结构发生变化，导致其变性和聚集；(3)蛋白质分子之间的相互作用[6, 19]。高压下CO2与蛋白质之间通过疏水相互作用、静电斥力和氢键等的作用使蛋白质肽链伸展而发生变性，蛋白质分子之间又通过疏水相互作用、二硫键、非二硫共价键等作用而发生聚集和交联，从而形成三维网状结构的凝胶。因此，高压下CO2诱导的鱼糜凝胶品质优于传统热诱导的。另外，凝胶强度与凝胶的微观组织结构也密切相关，一般来讲，凝胶网络孔径越小、分布越均匀越致密，其凝胶强度就越大。从虾肉糜凝胶的感官评价和微观结构观察可知，热诱导的虾肉糜凝胶网络孔径较大且分布不均匀，而高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶网络孔径小且分布均匀致密。因此，高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶强度较大。

图4 虾肉糜凝胶的强度Fig.4 The strength of shrimp surimi gel

由图4还可以看出，高密度CO2混合溶解和扩散方式诱导的虾肉糜凝胶强度显著高于高密度CO2纵向溶解和扩散的(P<0.05)，高密度CO2纵向溶解和扩散的虾肉糜凝胶强度又显著高于高密度CO2横向溶解和扩散的(P<0.05)，这可能与在高密度CO2溶解和扩散过程中CO2与虾肉糜的接触面积以及高密度CO2进入处理釜的气流方向等有关。CO2与虾肉糜在高密度CO2的混合溶解和扩散过程中接触的表面积分别是纵向和横向的2倍，这使高密度CO2混合溶解和扩散在单位时间内有更多的CO2与虾肉糜蛋白质发生相互作用，使虾肉糜快速形成均匀而致密的组织结构。虽然CO2与虾肉糜在高密度CO2纵向溶解和扩散与横向溶解和扩散过程中接触的表面积是相等的，但是CO2进入处理釜的气流是纵向的，这可能使CO2纵向溶解和扩散的速度大于横向溶解和扩散的速度，高密度CO2纵向溶解和扩散在单位时间内有更多的CO2与虾肉糜蛋白质发生相互作用，使虾肉糜相对快速地形成均匀而致密的组织结构。

2.4 虾肉糜凝胶的保水性

保水性是指当肉或肉制品在加工或贮藏过程中保持其原有水分与添加水分的能力。保水性是鱼糜制品的一种主要品质指标。一般来说,保水性越高,鱼糜制品的质量就越好。由图5可以看出,与未处理的虾肉糜相比,热诱导和高密度CO2诱导虾肉糜凝胶的保水性都显著下降(P<0.05)。在热和高密度CO2诱导下,虾肉糜逐渐向凝胶结构转变,虽然凝胶的三维网状结构有利于锁住水分[20],但是由于热和高密度CO2处理使虾肉糜蛋白质发生变性使疏水性基团暴露,导致蛋白质结合水的能力下降[21],部分水分析出而使其保水性下降,这与前人的研究结果一致。李睿智等[22]研究发现在热诱导鱼糜形成凝胶过程中,蛋白质变性使疏水基团暴露导致其保水能力下降。由图5还可以看出,高密度CO2诱导虾肉糜凝胶的保水性显著高于热诱导(P<0.05),这可能与虾肉糜的微观结构有关。与热诱导的虾肉糜凝胶相比,高密度CO2诱导虾肉糜凝胶的微观结构的孔径更细小、也更加均匀和致密,这可能使其中的水分不容易从凝胶内部渗漏出来。

图5 虾肉糜凝胶的保水性Fig.5 Water holding capacity of shrimp surimi gel

2.5 虾肉糜凝胶的水分分布状态

图6为虾肉糜凝胶水分的T2弛豫信息。氢质子受束缚越大或自由度越小，T2弛豫时间越短[21]。由图6可以看出，与虾肉糜凝胶的水分驰豫时间相对应的峰有4个，其弛豫时间分别用T20、T21、T22和T23表示，分别对应凝胶中水分子的不同状态[23]。弛豫时间T20和T21位于0～10 ms，可归于虾肉糜凝胶体系中的结合水(与蛋白质分子紧密结合的水)；弛豫时间T22位于30～100 ms，表示虾肉糜凝胶体系中的不易流动水(虾肉糜凝胶内大分子截留水)；弛豫时间T23>400 ms，表示虾肉糜凝胶体系中的自由水。

图6 虾肉糜凝胶的水分弛豫时间T2的分布Fig.6 Water relaxation time(T2)of shrimp surimi gel

图7为4种状态水弛豫时间T2的变化,由图7可以看出,不同处理对虾肉糜中T20和T21的弛豫时间影响差异不显著(P>0.05),这可能是因为结合水是与大分子紧密结合的水,一般的加热或者机械处理并不能显著改善结合水的结合状态。3种高密度CO2处理的虾肉糜凝胶的T22均比热诱导的T22长(P<0.05),且3种高密度CO2方法间差异性不显著(P>0.05),表明与热诱导法相比,高密度CO2诱导虾肉糜凝胶可以有效抑制虾肉糜中不易流动水的流动性的增加。热诱导虾肉糜凝胶中存在4种状态的水分子,比高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶多一个自由水(T23)。这可能是因为热处理过程中,蛋白变性形成三维凝胶网络结构,导致部分不易流动水转化成自由水。

图8为各处理组中不同状态水分百分比含量变化。由图8可以看出,在虾肉糜凝胶体系中,不易流动水的相对百分含量最大。热诱导或高密度CO2诱导虾肉糜形成凝胶的过程中,肌球蛋白在氢键、静电斥力、疏水相互作用、非二硫共价键等的作用下高级结构会发生松散,肽链伸展,然后又在氢键、疏水相互作用、非二硫共价键、二硫键等的作用下分子之间又会发生聚集和交联,从而形成三维网状结构并具有一定弹性的凝胶[15,19]。在这个过程中,蛋白质分子极化基团静电荷与水分子极化基团静电荷之间的引力构成吸水作用,将肉糜中的多数水分子纳入网状立体结构的空间形成不易流动水[24]。

a-T20;b-T21;c-T22;d-T23图7 虾肉糜凝胶的水分弛豫时间T2Fig.7 Water relaxation time T2 of shrimp surimi gel

高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶与热诱导的虾肉糜凝胶在结合水(T20和T21)的相对百分含量上无显著差异(P>0.05),但高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶的不易流动水(T22)相对百分含量显著高于热诱导的虾肉糜凝胶(P<0.05);高密度CO2三种溶解和扩散方式诱导的虾肉糜凝胶在结合水(T20和T21)和不易流动水(T22)的相对百分含量上无显著差异(P>0.05)。这与虾肉糜凝胶的微观结构密切相关。从感官评价和微观结构分析中可知,热诱导虾肉糜凝胶的组织疏松,凝胶网络孔径较大,很容易使不易流动水转变为自由水而损失,而高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶组织致密,凝胶网络孔径均匀而且较小,从而锁住了不易流动水。该结果与前面分析的保水性、凝胶强度和微观结构的结果相一致。这也充分说明高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶在品质方面显著优于热诱导。

2.6 虾肉糜凝胶的微观结构

鱼糜凝胶的微观结构与其凝胶强度、保水性和水分状态等品质指标都有直接的关系。一般来讲,鱼糜凝胶网络孔径越细小、纹理结构越平整细腻,越容易锁住更多的水分,其凝胶强度就越高,保水能力就越好。

由图9可以看出,热诱导和高密度CO2诱导的虾肉糜凝胶的显微结构存在显著的差异。热诱导凝胶的网络结构的孔径较大且分布不均匀,纹理粗糙且不平整。高密度CO2诱导凝胶的网络结构的孔径较小且均匀致密,纹理细腻且平整。高密度CO2三种溶解和扩散方式诱导的凝胶在显微结构上差异较小,但高密度CO2混合溶解和扩散诱导凝胶的网络结构的孔径更加细小均匀致密,纹理也更加细腻平整。RAWDKUEN等[25]认为规则的结构是更强的凝胶强度的内在原因。水煮加热由于加热速度慢和传质不均匀通常会使鱼糜凝胶的网络孔径较大而且不均匀[26]。高密度CO2处理条件下,CO2在超临界状态下的表面张力为零,使其在肉糜中溶解和扩散比较均匀,有利于形成孔径较小而且均匀致密的凝胶网络结构。

图9 虾肉糜凝胶的微观结构图(×1 500)Fig.9 Microstructure of shrimp surimi gel (×1 500)

3 结论

以热诱导的虾肉糜凝胶为对照,分析了高密度CO2纵向、横向和混合等3种溶解和扩散方式诱导的虾肉糜凝胶的品质特性。与热诱导的虾肉糜凝胶相比,3种高密度CO2诱导方式均提高了虾肉糜凝胶的感官品质和凝胶品质。3种高密度CO2的溶解和扩散方式对虾肉糜凝胶的主要营养成分、感官评分、保水性和微观结构等无显著影响。但高密度CO2混合溶解和扩散方式制备的凝胶强度显著高于纵向溶解和扩散组。因此,综合虾肉糜凝胶的各种品质指标,混合溶解和扩散法可以用于制备高品质的虾肉糜凝胶。