模拟高原环境下实验动物富氧系统的构建及应用

崔锦秀，马倩倩,2，翟明明，张晨旭，刘 娟，李远辙，罗二平，汤 池,3

(空军军医大学：1军事生物医学工程学系军事医学装备与计量学教研室，3陕西省生物电磁检测与智能感知重点实验室，陕西 西安 710032；2西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

青藏高原平均海拔高度4 500 m以上，随着青藏铁路的开通运行，越来越多的人由平原前往高海拔地区进行科研、商务和旅行等。由于高海拔地区大气压低于平原地区，导致氧分压降低，众多世居平原人群会因氧分压降低而受到高原病的困扰，包括头痛、恶心、疲劳和失眠等，甚至发生高原肺水肿、高原脑水肿等危及生命的情况[1-3]。

为了降低高原病的发生率，科研学者们研发了便携式高压舱和富氧室等众多设备[4-6]。这些设备通过提高局部氧气浓度进而改变氧分压，最终使等效生理海拔高度降低。近年来，富氧室的构建及应用备受学者关注。现有数据已经证明了富氧室可有效改善受试者动脉血氧饱和度、脉搏率、血压等[7]。

虽然富氧供给已经在理论上被普遍认为是最有效的抗缺氧手段之一，并从睡眠结构、脑体功效等宏观方面得到了证实[8-9]。但富氧是否可有效改善低压低氧所引起的心肺和脑组织等的器质性损伤，亟需进行动物在体实验进行验证。在低压低氧环境下进行富氧防护组织器官的效果研究，必要条件之一为构建动物实验用富氧系统。现有富氧供给多采用分子筛制取高浓度氧或者氧气瓶供给高纯氧，然后与空气混合稀释，使氧浓度降低至50%以下后构建富氧环境，这增加了富氧氧气浓度调节与控制的复杂度[10]。本研究拟基于膜分离技术，直接从空气制取约30%浓度的富氧空气，与独立通气笼(individual ventilated cage，IVC)组合构建动物实验用富氧系统，并对其效果进行初步验证。

1 材料与方法

1.1 材料

15只7周龄健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠，购自空军军医大学实验动物中心。实验获得了空军军医大学动物伦理委员会批准(许可证号：IACUC-20220405)。动物在标准环境下饲养：12 h/12 h明暗交替，温度调节为(22±1)℃，自由摄食、饮水。

适应性饲养1周后，将动物随机分成正常(normal control，NC)组、低压低氧(hypobaric hypoxia，HH)组和低压富氧(hypobaric oxygen-enrichment，HO)组，每组5只。NC组置于当地环境下(海拔400 m)不进行任何干预；HH组置于模拟海拔5 000 m环境下；HO组同样置于模拟海拔5 000 m环境下并进行局部富氧干预(8 h/d)。实验进行7 d后，使用过量的20 g/L戊巴比妥钠麻醉剂对大鼠进行腹腔注射，安乐死后取脑组织。

1.2 方法

1.2.1 动物实验富氧系统组建 富氧设备由直流风扇、板式富氧膜元(上海穗杉实业股份有限公司)、真空泵(成都新为诚科技有限公司)和缓冲气缸组成。富氧空气通过氧气分析仪(Oxymat 61，西门子，德国)对氧浓度进行检测。在温度为25 ℃、海拔400 m环境下，本研究对富氧膜在不同压力比(压差)下的氧浓度和富氧空气流量进行了检测。此外，富氧设备进行整机组装后，置于低压低氧舱内，检测富氧浓度和流量随海拔升高变化情况。氧气流量通过玻璃转子流量计测得。

将富氧设备与大鼠IVC对接，将富氧空气通入IVC，从而在低压低氧舱内建立小型富氧室，实现局部富氧，并对不同模拟海拔高度下，富氧笼内外海拔高度以及笼内富氧浓度进行检测。富氧系统原理如图1所示。

图1 动物实验富氧系统原理图

1.2.2 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色 富氧系统组装调试结束后，进行动物实验以验证其使用效果，选用HE染色观察大鼠脑组织形态学变化。造模结束后，大鼠经腹腔注射过量麻醉剂，处死后于冰上迅速分离全脑，浸泡于40 mL/L多聚甲醛溶液内，完全固定后使用石蜡包埋并切片。将大脑石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗。切片置于苏木精染液染3～5 min后蒸馏水洗，分色后流水冲洗并脱水，然后浸入伊红染液中染色5 min，脱水后经二甲苯透明、封片。染色完成后，在光镜下观察各组大鼠海马区病理改变。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 富氧膜元特性

富氧浓度和富氧流量与单元膜压力比的关系如图2所示。富氧浓度与压力比的对数拟合曲线为y1=3.193 1·ln(x1)+25.234(R12=0.949 3)。富氧流量与压力比的多项式拟合曲线为y2=-0.116 3x22+1.180 9x2+0.348 6(R22=0.934 5)。即富氧浓度及富氧流量与单元膜压力比均为非线性关系。根据两曲线拟合结果，认为单元膜压力比为4时，富氧膜元特性较优。

2.2 富氧设备特性

基于富氧膜元特性，组装富氧设备并测试其性能。实验结果显示，随着低压低氧舱内海拔高度的升高，富氧设备整机的富氧浓度逐渐降低，因此海拔高度与富氧浓度呈负相关性(图3)，拟合曲线为y3=-0.076 8x32-0.396 8x3+32.017(R32=0.878 1)。富氧设备的流量与海拔高度也呈负相关性(图3)，拟合曲线为y4=0.017 3x42-0.470 4x4+8.343 3(R42=0.956 3)。

2.3 富氧系统特性

将富氧设备与IVC对接，构建弥散富氧系统并测试其性能。实验结果显示，富氧笼内海拔高度与低压低氧舱内海拔高度基本保持一致；随着海拔升高，笼内富氧浓度逐渐降低(图4)。

2.4 富氧系统应用验证

HE染色结果显示，NC组海马CA1区锥体神经元形状规则，排列整齐；HH组海马CA1区锥体神经元深染，排列散乱；而HO组海马CA1区锥体神经元深染状况明显减少。可见，低压低氧条件下大鼠海马CA1区锥体神经元变性数量增多，而富氧干预可以有效减轻锥体神经元变性(图5)。

A：NC组；B：HH组；C：HO组。标尺为50 μm。黑色箭头：海马CA1区。

3 讨论

急进高原人群饱受低压低氧导致的急性高原反应和其他高原病影响，目前最直接有效的防治手段即为吸氧。为了缓解、改善鼻导管或面罩给人鼻腔带来的不适感，降低鼻导管或面罩对人体动作的限制，研究人员提出弥散富氧新方式[11-12]。并且，现有研究已经证明了弥散富氧可有效缓解高原对人机体的影响[13]。但弥散富氧时间、弥散富氧防护机制等有待进一步研究。为了保证弥散富氧动物实验的顺利开展，本研究基于膜分离技术，构建了一套弥散富氧系统，并通过动物实验验证了其在模拟高原低压低氧环境中的应用效果。

本研究发现，随着跨膜压力的增加，富氧浓度和富氧流量首先呈现线性增加趋势，随后逐渐放缓。因此，通过真空泵制造压差，与膜元联用可以用于制取富氧空气。通过调节压力及膜元的面积，实现制取富氧浓度和富氧流量的较优配比。富氧设备组装完毕后，通过低压低氧舱实验发现，随着海拔高度上升富氧浓度和富氧流量均有所降低，这可能与低压环境下真空泵的效能受到影响有关。真空泵性能下降，导致富氧膜元的内外压差产生变化，致使富氧浓度和富氧流量下降。将富氧设备与IVC进行组合后，在低压低氧舱内分别对舱内和笼内海拔进行实时监测发现海拔高度基本保持一致，这就为后续动物实验排除了压力这一干扰因素。当富氧笼内进气流量大于出气流量时，会造成笼内气压升高，使笼内模拟海拔高度低于舱内。这就无法解释弥散富氧究竟是提升压力，还是提升氧浓度起到了防护低压低氧对机体影响的作用。随着低压低氧舱内海拔升高，虽然富氧笼内模拟海拔与舱内基本保持一致，但是笼内弥散富氧浓度却呈下降趋势，这与富氧设备性能下降直接相关。最终，富氧笼内氧浓度维持在25%以上，为进行动物弥散富氧干预实验提供了硬件支撑。

本研究为了验证弥散富氧系统的应用效果，选取大鼠进行实验，发现HO组较HH组大鼠的海马CA1区锥体神经元受低压低氧损伤的区域和数量明显减少。ZHU等[14]研究发现，虽然5 000 m模拟海拔对大鼠空间学习和记忆能力的影响是微弱的，但是海马CA1区锥体神经元分布散乱、变性、固缩，甚至坏死。本研究的结果与其课题组研究结果相一致，即5 000 m模拟海拔使大鼠产生形态学损伤，而富氧系统有效防护了这种影响[15]。

综上所述，本研究构建了一套动物实验弥散富氧系统，可以实现模拟海拔5 000 m以下、富氧浓度≥25%的弥散富氧环境，初步验证了富氧防护效果，为后续弥散富氧防护机制及应用方案研究提供了硬件保障。