微波辅助一锅串联高效合成多样性吖啶酯及其D-A-D 型pH 荧光探针的应用

许根瑞，李伟强，吴沁，张周，黄超

(云南民族大学 化学与环境学院，生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程研究中心，云南省高校智能超分子化学重点实验室，云南 昆明 650503)

pH 在自然界发挥重要作用[1-3]，对pH 值的实时监测一直是化学、生物、环境、医疗等领域研发的重要方向[4-5].目前传统的pH 测定方法存在精准度低、损害样品等局限[6-7]，而pH 荧光探针法具有响应迅速、可连续监控、灵敏度高、可应用于生物成像等优点[8]，近年来受到广泛关注.

吖啶酯类化合物是一种量子产率高、生物适应性好、已部分商业化应用于化学免疫分析、DNA检测以及光电材料等领域的试剂[9-10]，其制备方法和发光应用是研究热点[11].已报道的吖啶酯制备方法，主要集中在吖啶母环的构建上，普遍涉及了几种类型的闭环反应，如采用二苯胺与羧酸类化合物在ZnCl2的催化合成，以及芳香胺或叠氮化物与苯甲醛经Pd 或Rh 催化合成等方式[12-14]，传统方法存在效率低、底物耐受性有限、适用范围小、过程不绿色等问题.因此，探索绿色高效制备方法及开发新型pH 荧光探针具有较好应用前景.

基于本课题组前期pH 荧光探针[15]和微波辅助高效合成杂环化合物工作[16]，我们以靛红与芳基硼酸衍生物为原料，微波辅助乙醇介质下，一锅两步高效串联合成具有分子多样性的吖啶酯类化合物，利用该方法设计、合成D-A-D 型的吖啶酯，并研究了其pH 荧光探针性质.如图1 所示.

图1 吖啶酯的两步一锅法合成方法及底物扩展Fig.1 Two-step one-pot synthesis method and substrate expansion of acridinium esters

1 实验部分

1.1 仪器与试剂GF-254 高效薄层色谱硅胶板(TLC)，山东青岛海洋化工厂；BSA224S-CW 电子天平，赛多利科学仪器(北京)有限公司；Discover(单模)型微波合成仪，美国CEM 公司；Bruker AvanceⅢc-400 MHz 核磁共振波谱(NMR)仪，德国Bruker公司，以CDCl3为溶剂进行测试，TMS 为内标；pH计FE28，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Aglient Cary Eclips 荧光光谱仪计，美国安捷伦公司.

乙醇(纯度99%)、浓硫酸(纯度98%)、超纯水、二氯甲烷与乙酸铜(纯度98%)，上海皓鸿生物医药科技有限公司；靛红衍生物(纯度99%)和芳基硼酸类衍生物(纯度99%)，上海泰坦科技股份有限公司；所用试剂均为化学纯或分析纯.

1.2 实验方法目标化合物3a～3l 的合成 以靛红1（0.5 mmol）和苯硼酸2（1.5 mmol）为底物，加入干燥的10 mL 微波反应试管中，以2.5 mL 醇为溶剂，再加入0.5 mmol 乙酸铜，1 mmol 三乙胺，置于微波合成仪中预搅拌30 s，在60 ℃下搅拌反应30 min，用TLC 监测反应至完成后，不经过任何处理，再次在微波管中加入10 mmol 浓硫酸，放置于微波合成仪中，125 ℃下反应30 min，用TLC 监测反应至完成；将反应溶液加入乙酸乙酯、饱和食盐水萃取分离，有机相用无水硫酸钠干燥过滤，所得滤液经旋转蒸发除去溶剂得粗产品，粗产品经柱层析（0.054～0.077 mm,200～300 目）提纯得到相应目标产物3.化合物3 的详细条件筛选及核磁共振波谱谱图见支撑文件.

吖啶-9-羧酸乙酯 (3a) 黄色固体；收率86%；熔点 61～63 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ: 8.12(dd，J=8.8 Hz，2H)，7.93～7.84 (m，2H)，7.63 (p，J=7.8 Hz，2H)，7.42 (p，J=7.9 Hz，2H)，4.61～4.49 (m，2H)，1.42～1.33 (m，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ: 167.5，148.7，137.2，130.3，129.9，127.1，125.1，122.3，62.4，14.5；HRMS (ESI) C16H14NO2+[M+H]+m/z：计算值252.101 6，实测值252.1019.

2-甲氧基吖啶-9-羧酸乙酯 (3b) 黄色固体；收率76%；熔点 93～95 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.22 (dd，J=8.8 Hz，1H)，8.14 (d，J=9.5 Hz，1H)，8.01～7.99 (m，1H)，7.75～7.71 (m，1H)，7.60～7.58 (m，1H)，7.48 (dd，J=9.5 Hz，1H)，7.19 (d，J=2.7 Hz，1H)，4.70 (q，J=7.1 Hz，2H)，3.96 (s，3H)，1.55 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：168.0，158.2，147.1，146.2，134.5，131.7，130.1，129.2，127.3，125.8，124.7，123.7，122.9，100.3，62.3，55.6，14.6；HRMS (ESI) C17H16NO3+[M+H]+m/z：计算值282.112 0，实测值282.1125.

2，7-二甲氧基吖啶-9-羧酸乙酯 (3c) 黄色固体；收率72 %；熔点 98～100 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.11 (dd，J=9.4，2H)，7.43～7.39 (m，2H)，7.18 (d，J=2.7 Hz，2H)，4.70 (q，J=7.1 Hz，2H)，3.99～3.92 (m，6H)，1.56 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：168.0，158.4，144.1，131.5，124.4，124.1，100.3，62.1，55.6，14.7；HRMS (ESI)C18H18NO4+[M+H]+m/z：计算值312.123 1，实测值312.1230.

吖啶-9-羧酸甲酯 (3d) 黄色固体；收率89%；熔 点 43～46 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.28～8.25 (m，2H)，8.01～7.99 (m，2H)，7.81～7.77(m，2H)，7.60～7.56 (m，2H)，4.19 (s，3H)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：168.0，148.6，137.2，130.6，129.8，127.3，125.3，122.5，53.1；HRMS (ESI)C15H12NO2+[M+H]+m/z：计算值238.086 2，实测值238.0863.

吖啶-9-羧酸丙酯 (3e) 黄色固体；收率85%；熔点 76～79 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.25(d，J=8.8 Hz，2H)，8.01 (d，J=8.7 Hz，2H)，7.78～7.74 (m，2H)，7.58～7.53 (m，2H)，4.60～4.56(m，2H)，1.91～1.85 (m，2H)，1.06～1.02 (m，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.7，148.7，137.3，130.3，130.0，127.1，125.2，122.4，68.0，22.2，10.6；HRMS (ESI) C17H16NO2+[M+H]+m/z：计算值266.117 4，实测值266.117 6.

再次，要有底线。中国共产党从民主革命时期走到现在，经历了各种艰难困苦，特别是在和平年代，社会主义市场经济的飞速发展使一些不良思想有一定抬头，这就要求思想的坚定和政治信仰的坚定就非常重要了。所以，这就意味着每一名党员必须要牢固树立底线意识，作为青年学生，在日常工作、生活中，我始终坚守底线，要有自己的原则，坚持自己的政治信仰，要立志为社会主义事业贡献自己的力量。

2-氟吖啶-9-羧酸乙酯 (3f) 黄色固体；收率79%；熔点 121～124 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.29～8.22 (m，2H)，8.06～8.03 (m，1H)，7.81～7.77 (m，1H)，7.66 (dd，J=9.9 Hz，1H)，7.64～7.58 (m，2H)，4.70 (q，J=7.2 Hz，2H)，1.55 (t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.3，161.9，159.4，148.4，148.3，146.3，136.4，136.3，133.0，132.9，130.3，130.3，130.2，127.9，124.9，122.9，122.8，122.8，122.4，122.2，107.7，107.4，62.7，14.6；HRMS (ESI)C16H13FNO2+[M+H]+m/z：计算值270.092 3，实测值270.0925.

2-氯吖啶-9-羧酸乙酯 (3g) 黄色固体；收率76%；熔点 127～129 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.26～8.18 (m，2H)，8.08～8.00 (m，2H)，7.84～7.80 (m，1H)，7.72 (dd，J=9.3 Hz，1H)，7.65～7.61 (m，1H)，4.72 (q，J=7.2 Hz，2H)，1.56 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.2，148.9，147.1，136.2，133.3，131.8，130.7，130.2，127.9，125.2，123.7，122.8，122.8，62.8，14.6；HRMS (ESI)C16H13ClNO2+[M+H]+m/z：计算值286.063 0，实测值286.0629.

2-溴吖啶-9-羧酸乙酯 (3h) 黄色固体；收率81%；熔点 131～134 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.30～8.21 (m，2H)，8.05 (d，J=8.7 Hz，1H)，7.81～7.77 (m，1H)，7.66 (dd，J=8.9 Hz，1H)，7.64～7.57 (m，2H)，4.70 (q，J=6.5 Hz，2H)，1.55 (t，J=7.2 Hz，2H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：171.3，138.4，137.5，135.8，135.3，132.3，131.3，130.9，130.4，129.8，129.6，128.7，127.7，127.4，127.2，125.6，118.1，60.5，14.3；HRMS (ESI) C16H13BrNO2+[M+H]+m/z：计算值330.012 5，实测值330.0124.

2-甲基吖啶-9-羧酸乙酯 (3i) 黄色固体；收率79%；熔 点 102～107 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.24 (d，J=8.8 Hz，1H)，8.15 (d，J=8.9 Hz，1H)，7.99～7.98 (m，1H)，7.79～7.73 (m，2H)，7.64(dd，J=8.9 Hz，1H)，7.58～7.56 (m，1H)，4.71 (q，J=7.2 Hz，2H)，2.58 (d，J=1.1 Hz，3H)，1.55 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.9，148.2，147.9，137.3，136.1，133.4，130.1，129.9，129.7，1271.，125.1，123.2，122.6，62.4，22.3，14.6；HRMS (ESI)C17H16NO2+[M+H]+m/z：计算值 266.117 5，实测值266.1176.

2-叔丁基吖啶-9-羧酸乙酯 (3j) 黄色固体；收率73%；熔点：113～116 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.26～8.18 (m，2H)，8.03～8.00 (m，1H)，7.93～7.88 (m，2H)，7.77～7.75 (m，1H)，7.59～7.57(m，1H)，4.72 (q，J=7.1 Hz，2H)，1.56 (t，J=7.2 Hz，3H)，1.44 (s，9H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.9，149.8，148.4，147.9，136.8，130.2，130.0，130.0，129.6，127.0，125.1，122.6，122.3，119.2，62.3，35.5，30.9，14.7；HRMS (ESI) C20H22NO2+[M+H]+m/z：计算值 308.164 2，实测值308.1645.

苯并[a]吖啶-12-羧酸乙酯 (3k) 黄色固体；收 率80%；熔 点88～91 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.46～8.43 (m，1H)，8.31～8.26 (m，1H)，8.02～7.95 (m，2H)，7.87～7.77 (m，3H)，7.64～7.55(m，3H)，4.72～4.67 (m，2H)，1.42 (t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：170.1，149.7，147.3，136.0，132.9，132.4，130.1，129.4，129.2，128.8，128.6，128.0，127.2，127.1，125.8，124.7，122.8，119.6，62.6，14.0；HRMS (ESI) C20H16NO2+[M+H]+m/z：计算值302.117 3，实测值302.1176.

2，7-二氟吖啶-9-羧酸乙酯 (3l) 黄色固体；收率71%；熔点108～110 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.25 (dd，J=9.5Hz，2H)，7.69 (dd，J=9.9 Hz，2H)，7.62～7.57 (m，2H)，4.70 (q，J=7.1 Hz，2H)，1.55(t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：166.8，162.4，159.9，145.8，135.3，135.3，133.2，133.1，123.4，123.3，122.3，122.0，107.5，107.5，107.3，62.8，14.6；HRMS (ESI) C16H12F2NO2+[M+H]+m/z：计算值288.083 0，实测值288.083 1.

图2 3a、3b、3c 分子结构Fig.2 Molecular structure of 3a,3b,3c

1.4 标准溶液的制备用分析天平称取待测化合物3a、3b、3c 各0.01 mmol，分别移至10 mL 容量瓶中，以V（乙醇）∶V(水)=1∶4 的混合液为溶剂溶解化合物，配置成浓度1×10-3mol/L 溶液作为母液待用.同时采用NaH2PO4、Na2HPO4为缓冲剂，以上述溶剂配制1.0 mol/L 盐酸、氢氧化钠溶液对pH 值进行微调，制备具有不同pH 值的缓冲溶液.取50 μL 母液置于5 mL 比色皿中，用不同pH 值的缓冲液稀释，制备一系列具有不同pH 值的1×10-5mol/L 探针溶液.

2 结果与讨论

2.1 反应底物的扩展以靛红衍生物与苯硼酸衍生物为原料，微波辅助下一锅两步法顺序进行Chan-Lam[18]等多步串联反应，在上述优化后的最佳反应条件下，通过改变不同取代基的靛红、芳基硼酸以及醇对合成吖啶酯类化合物3a 的反应进行普适性研究.结果表明，无论R1为供电子基团还是吸电子基团，产率变化不大.同时研究了空间位阻对反应的影响，当对位为叔丁基或苯环等大基团取代时，也能以良好的产率得到目标产物.当R1为卤素取代时有良好的反应性，且产率能达到76%.当R3基团改变时，产率没有明显变化.最后，当吖啶酯为双取代时也能得到目标产物，反应产率略有降低.因此，此合成方法反应条件简单且普适性较广.

2.2 化合物荧光测定在母液中分别取探针3a、3b、3c 溶液各50 μL 置于3 个5 mL 的比色皿中，用V(乙醇)∶V(水)=1∶4 溶剂稀释，制得浓度为1×10-5mol/L 的溶液，用荧光光谱法分析测定其吸收光谱和荧光光谱，结果如图3 所示.

从图3 中我们可以看出，当吖啶酯在母环区接入甲氧基时，探针的吸收和荧光光谱都发生了红移现象，且3b (D-A)的激发波长出现了明显的双峰结构，表现出吖啶酯3a (A)向2,7-二甲氧基吖啶酯3c (D-A-D)过渡的状态.

图3 样品在标准溶液中的激发波长（a）和发射波长(b)Fig.3 Excitation and emission wavelengths of samples in standard solutions

如图4 所示，当我们保持探针样品浓度为1×10-5mol/L，pH 值不同时，溶液的荧光强度发生了明显的变化，且探针在酸性缓冲溶液（pH 0～7）下荧光光谱发生了荧光猝灭现象（如小图右上所示），而在碱性缓冲溶液（pH 8～14）下荧光强度却没有发生明显的荧光改变（如小图右中所示）.

图4 探针3a、3b、3c 在pH 0～14 的缓冲溶液中响应情况Fig.4 Response of probes 3a,3b,3c in buffer solution at pH 0-14

为了进一步分析吖啶酯在酸性缓冲溶液下的荧光表现，我们将 pH 值的区间控制在 0.5 左右，即pH 0～7.5，再次进 行荧光分析测定，结果如图5 所示.

由图5，我们发现随着pH 值的降低荧光强度逐渐下降，且探针3a 的发射波长出现了略微的红移现象，而3b、3c 的发射波长几乎保持不变，及在498 nm 与530 nm 左右存在一个等吸收点，表明探针在缓冲溶液中存在酸碱电离平衡[19].为了探讨探针对不同pH 值的依赖性，我们以探针3a、3b、3c 的pH 响应作I/Imax与pH 值的函数，其中I是测量的荧光发射强度，Imax是探针的最大输出.如图6所示，发现3a、3b、3c 的荧光强度随着pH 值的降低而降低，在酸性条件下显示出良好的指示性能，其中3c 表现最佳，在pH 值1.94～4.06 中表现出明显的线性关系，为后续吖啶酯类pH 荧光探针的应用提供支撑.

图5 探针3a、3b、3c 在pH 0～7.5 的缓冲溶液中响应情况Fig.5 Response of probes 3a,3b,3c in buffer solution at pH 0-7.5

图6 pH 与荧光强度比值Fig.6 pH to fluorescence intensity ratio

2.3 机理探讨

2.3.1 合成吖啶酯可能的机理 根据吖啶酯的合成实验结果与前人的文献报道[20]，提出了该反应的可能机理(图7).以产物3a 为例，靛红(1a)与芳基硼酸(2a)在微波辅助乙醇介质下，利用铜盐与碱催化发生Chan-Lam 反应，合成中间体N-苯基靛红(I).产物N-苯基靛红(I)在硫酸的作用下，发生开环和磺化反应形成产物Ⅱ，Ⅱ的3 号羰基位点在酸性作用下发生分子内亲核反应，与苯环的邻位C 偶联形成过渡态Ⅲ，Ⅲ再脱水形成吖啶磺酸酯Ⅳ，Ⅳ在乙醇相中发生酯交换，得到产物3a.

图7 可能的合成反应机理Fig.7 Possible mechanisms of synthesis

2.3.2 pH 荧光探针可能的机理 由于吖啶酯刚性骨架结构的影响，其N 原子上存在的孤对电子可以与质子发生作用[21]，因3a、3b、3c 对酸性都有荧光响应，而碱性无明显的响应情况，提出pH 荧光探针可能的机理，见图8.探针分子在质子化后，发生了荧光猝灭，随着pH 值的降低，H+浓度的升高，探针的质子化也愈加严重，溶液的荧光强度逐渐降低.当R1、R2基团接入甲氧基这一具有供电性的基团时，母环上的电子云密度更大，N/NH+推拉电子引起的共振效应更明显，表现出H+在更大的pKa情况下与N 络合，扩大了探针在酸性pH 值下的监测范围.

图8 可能的探针反应机理Fig.8 Possible mechanisms of probes

3 结论

综上所述，本文以靛红、芳基硼酸衍生物为原料，在微波辅助醇介质下，一锅法高效串联环化合成了12 个吖啶酯类化合物，并设计合成D-A-D 型的吖啶酯，获得了具有酸响应的pH 荧光探针.该方法利用微波辅助合成，具有原料简单易得、成键效率高、反应时间短以及收率良好等特点.基于本文报道的合成方法，D-A-D 型的吖啶酯显现在酸性体系下能够灵敏监测pH 值的变化，有望在pH 实时监测中获得开发应用.