60Co辐射诱导水稻短穗小粒突变体sp18的表型鉴定与基因定位

陈能刚， 鄢小青， 李 欢， 陈 锋

(贵州省农业科学院农作物品种资源研究所， 贵阳 550006)

水稻是重要的粮食作物，对保障粮食安全具有重要作用。水稻理想株型育种是提高水稻产量的重要研究方向之一，穗型是株型的重要组成部分，穗型发育突变体的发现与研究不仅是鉴定穗型发育功能基因的重要途径之一，也是水稻新品种选育、生物技术研究以及农业生产的物质基础，对水稻超高产育种和分子育种有着重要意义。

近年来，科学家在水稻穗型相关突变体、基因克隆以及激素调控等方面开展了深入研究，并取得重要进展。发现了许多与水稻穗型相关的调控基因，其中突变体dep1呈现直立穗[1]。sp1突变体表现出短穗表型[2]。pap2突变体产生多个轴枝梗，呈现簇状穗[3]。srs3籽粒呈现小圆粒表型[4]。dep2穗长变短是穗发育过程中细胞增殖减少所致[5]。sped1形成簇生小穗[6]。asp1/osrel2突变体的枝梗结构混乱，一次枝梗数量增加，二次枝梗数量减少[7]。本研究利用60Co辐射诱变贵州地方粳稻品种“桥港珍珠米”，获得一份短穗小粒突变体sp18(short panicle 18)。对sp18突变表型特征鉴定、遗传与分子标记连锁、全基因组重测序变异检测及候选基因进行分析，为基因克隆和功能分析以及分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

短穗小粒突变体sp18是利用贵州地方粳稻资源桥港珍珠米通过60Co辐射诱变获得的，经过连续多代自交，该突变表型能够稳定遗传。2019年3月在海南基地以正常表型的桥港珍珠米和籼稻R 1638为父本，分别配制sp18/桥港珍珠米和sp18/R 1638两个杂交组合，分别收获F1代种子，同年在贵阳种植F1代，F1自交构建F2遗传群体和F2定位群体。

1.2 遗传与分子标记连锁分析

在贵阳分别种植亲本、F1、F2代，在抽穗期观察各世代的表型差异。参照鄢小青等[8]的SDS法提取水稻新鲜叶片DNA，分别提取sp18、桥港珍珠米和R 1638以及F2群体中的突变混池和正常混池的极端混池用于基因定位。采用BSA法定位目标基因，从sp18/R1638的F2群体中选取10株正常单株和10株呈现短穗小粒的单株，分别等量混合成正常基因混池和突变基因混池。参照水稻基因组的SSR分子标记，利用籼稻9311和粳稻日本晴基因组间的差异，寻找多态性较好的SSR分子标记。通过3%的琼脂糖凝胶进行电泳，筛选在突变体sp18与R 1638间的多态性分子标记。然后用多态性好的分子标记分析正常基因池与突变基因池之间的多态性，找到目标基因连锁的分子标记后用F2群体中的隐性单株进行验证，确定该分子标记是否与突变性状连锁。

1.3 DNA文库构建、测序和变异检测分析

CTAB法提取样品DNA，通过Covaris破碎机将其打断为长度350 bp大小片段。采用TruSeq Library Construction Kit建库，文库构建完成后，使用Qubit 3.0进行初步定量，再使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，文库的有效浓度采用Q-PCR进行准确定量分析(文库有效浓度>2 nM)，待合格后进行illumina测序分析。通过BWA软件[9]对获得的有效测序数据(双亲和两个极端混池)与参考基因组比对分析，并经SAMTOOLS[10]去除重复。采用SAMTOOLS进行个体SNP和长度小于50 bp的小片段插入与缺失(InDel)进行检测。再利用Break Dancer软件[11]，基于pair-end reads比对到参考基因组上面的关系及实际insert size大小检测样品与参考基因组间的插入(insertion，INS)、缺失(deletion，DEL)、倒置(inversion，INV)、染色体内部迁移(intra-chromosomal translocation，ITX)、染色体间的迁移(inter-chromosomal translocation，CTX)。通过ANNOVAR对PE reads支持数小于2的DEL、INS、INV进行变异注释。最后利用CNVnator[12]对基因组上不同的reads 覆盖深度进行检测分析，判断潜在的deletion和duplication，并采用ANNOVAR进行变异注释。

2 结果与分析

2.1 表型鉴定与农艺性状调查

在田间，短穗突变体sp18与野生型相比，分蘖数无明显变化，而穗长变小，穗粒数明显减少，籽粒明显变小(图1)。成熟后，通过对sp18和野生型农艺性状调查发现，与野生型相比，突变体sp18的株高增加，有效穗没有显著变化，而结实率、穗长、穗粒数和千粒重较野生型显著减少(图2)。

图1 突变体sp18与野生型表型Fig.1 The phenotype observation of sp18 and wild-type

图2 突变体sp18与野生型农艺性状鉴定Fig.2 The identification on agronomic characterization of sp18 and wild-type

2.2 遗传与分子标记连锁分析

突变体sp18分别与正常的野生型和籼稻品种R 1638杂交，在贵阳分别种植亲本、F1、F2代，在抽穗期观察各世代的表型，结果F1代表现为野生型，F2代植株可分为野生型性状和突变型性状。经卡方(χ2)测验，其分离比例均符合3∶1(表1)，表明sp18的突变表型受1对隐性核基因控制。sp18与籼稻品种R 1638杂交获得的F2代群体作为基因定位群体，利用分布在水稻染色体上的SSR标记进行初步定位，研究发现，目标基因与第11号染色体上的分子标记RM 167和RM 27150连锁，物理距离分别为19.1 cM和41.5 cM处。

表1 杂交F2群体中短穗植株的分离情况Table 1 The isolation of short-spike plants in hybrid F2 population

2.3 变异检测分析

通过测序数据分析(表2)，本次测序共产生原始数据31.46 Gb，过滤后的有效数据31.23 Gb，有效率大于99%。野生型和突变体的GC含量分别为44.52%和44.55%，测序质量合格，GC分布正常，符合要求，可以进行后续分析。本研究以粳稻日本晴为参考基因组，其大小为375 049 285 bp，所有样本的比对率在96.67%～99.16%之间， 对参考基因组(排除N区)的平均覆盖深度在30.60～38.61 X之间，1 X覆盖度(至少有一个碱基的覆盖)在97.09%以上。比对结果正常，可用于后续的变异检测及相关分析。

表2 野生型(WT)和sp18测序数据质量情况汇总Table 2 Summary of wild-type (WT) and sp18 sequencing data quality

最终在野生型亲本和突变体sp18中分别检测到的SNP位点数为289 649和289 784，InDel个数分别为60 268和59 645，SV个数分别为8 207和7 510，CNV个数分别为4 722和4 402，变异检测结果正常(图3)。为了形象化展示样本中的结构变异，对数据进行如下处理：

1) 对于SNP和InDel，画出其在染色体上的密度分布；

2) 对于SV及CNV，画出它们在染色体上的位置及大小。

注：由外到内依次为染色体、SNP、InDel、CNV duplication、CNV deletion、SV insertion、SV deletion、SV invertion (SV ITX，SV CTX)。 图3 野生型和突变体的基因组结构变异分布 Fig.3 Distribution of structural variation in the genome of wild-type and mutant

2.4 候选基因筛选

结合分子标记与变异检测结果分析发现，sp18在第11号染色体上缺失于322 720 bp(7 189 868～7 512 630 bp之间)。通过水稻数据库http://rice.uga.edu对该缺失区间的功能基因进行注释(表3)。研究发现，该缺失区间包括Os11g0235200、Os11g0235700、Os11g0235750、Os11g0236000、Os11g0236100、Os11g0236200、Os11g0237900、Os11g0238000、Os11g0238400、Os11g0238700、Os11g0239000、Os11g0239200、Os11g0239400、Os11g0239500、

表3 候选基因注释信息Table 3 Candidate gene annotation information

Os11g0240600和Os11g0240900。其中Os11g0235200编码肽转运蛋白，为已克隆的短穗基因sp1。Os11g0236000编码磷酸甘油二酯磷酸二酯酶家族蛋白，通过数据库https://rapdb.dna.affrc.go.jp分析发现，与GH3基因(Os06g0499500)有关，参与生长素信号传导；Os11g0239500和Os11g0240600均编码赤霉素受体GID 1 L 2，参与赤霉素的调控。

3 结论与讨论

通过对sp18和野生型(桥港珍珠米)的表型特征分析发现，与野生型相比，sp18的株高有所增加，有效穗没有显著变化，而结实率、穗长、穗粒数和千粒重较野生型显著减少。sp18的表型特征与已报告的sp1呈现出相似的短穗小粒突变表型[2]，但株高与sp1存在差异表型。通过分子标记连锁分析，将候选基因初步定位于第11号染色体上的分子标记RM 167和RM 27150附近，物理距离分别为19.1 cM和41.5 cM处。经过全基因组重测序对sp18和野生型桥港珍珠米的基因组中SNPs、InDel、SV和CNV变异进行分析。结果表明，sp18在第11染色体上缺失322 720 bp(7 189 868～7 512 630 bp之间)。对sp18缺失区间相关基因的功能注释发现，在缺失区域内发现参与生长素信号传导和赤霉素调控相关的基因，包括Os11g0235200(短穗基因SP1)、Os11g0236000、Os11g0239500和Os11g0240600。Os11g0236000编码磷酸甘油二酯磷酸二酯酶家族蛋白，参与生长素信号传导，Os11g0239500和Os11g0240600均编码赤霉素受体GID 1 L 2，参与赤霉素的调控。因此，短穗小粒突变基因sp18为sp1的新等位基因，然而sp18突变体呈现出与sp1存在既相似又不同的突变表型特征，推测可能是由于sp18基因组大片段缺失，包括多个与植物激素相关的基因缺失而导致的。