清肤消肿散调控急性皮下蜂窝组织炎大鼠TGF-β1Smad信号通路的研究*

文 波 李 琦

四川省成都市新都区中医医院 610500

蜂窝组织炎是细菌局部感染或病变侵害导致的化脓性感染，表现为局部的红、肿、热、痛以及快速扩散[1]。大量研究显示其在中老年人中最常发生，其致病菌最常见的是溶血性链球菌。急性皮下蜂窝组织炎的特点主要是突然发病、发展迅速与病程凶险，如果不能得到及时有效的治疗，易导致一系列严重并发症[2]。目前临床对于蜂窝组织炎的治疗主要以综合治疗为主，包括给予营养支持、维持机体水电解质平衡、改善机体低蛋白血症及抗生素治疗[3]。近些年来中医临床对于急性皮下蜂窝组织炎的治疗也在逐步发展，清肤消肿散是我院治疗急性皮下蜂窝组织炎的临床经验组方，但对于其治疗作用机制尚未得出清晰认识。研究显示，TGF-β1/Smads信号转导可显著减轻组织损伤，且在急性皮下蜂窝组织炎的发展过程中TGF-β1水平与病情严重程度呈正相关。因此本研究以TGF-β1/Smads信号通路为切入点，探讨清肤消肿散治疗对于急性皮下蜂窝组织炎的具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠45只，清洁级，体重(220±20)g，实验动物在成都医学院动物实验中心饲养，饲养条件为Ⅱ级，光照周期12h/12h，室温在22～25℃之间，相对湿度为45%～60%，自由进食、饮水。

1.2 实验试剂 清肤消肿散为本院自制；ELISA试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；SYBR Green染料购自北京索莱宝科技有限公司；TRIzol Reagent总 RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时定量聚合酶链反应试剂盒购自美国英杰公司；TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7以及β-actin抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 动物分组：将SD大鼠45只随机分为正常对照组、模型对照组与研究组，每组15只。其中正常对照组不进行手术，模型对照组与研究组建立急性皮下蜂窝组织炎大鼠模型。模型制备后研究组大鼠给予清肤消肿散外敷治疗。治疗1周后处死所有大鼠并取皮下组织制备样本，保存于-20℃冰箱备用。

1.3.2 造模方法：每只SD大鼠通过向右旁腹上方皮肤注射0.2ml G族链球菌悬液以建立急性皮下蜂窝组织炎大鼠模型。

1.3.3 治疗方法：当模型制备成功1d后，研究组大鼠给予清肤消肿散在皮下蜂窝组织炎患处外敷治疗，2次/d。用药3d，共6次。

1.4 指标检测

1.4.1 通过ELISA检测各组大鼠外周血中TGF-β1、IL-8和TNF-α水平：取出部分大鼠皮下组织，以25ml/g加入生理盐水混合研磨后离心分离上清液，按照ELISA试剂盒步骤对样本TGF-β1、IL-8和TNF-α进行标记，测量吸光度后以标准曲线来计算其中TGF-β1、IL-8和TNF-α的含量。

1.4.2 RT-PCR法检测各组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平：取出部分大鼠皮下组织，将其置于液氮中磨碎，加入适量TRIzol试剂，通过匀浆机进行匀浆处理，随后进行分层、沉淀、清洗及溶解等步骤制得RNA备用。取制备好的总RNA进行反转录成cDNA，然后加入SYBR Green染料与TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及β-actin上下游引物混合，随后于PCR仪上进行扩增并定量分析。上述引物序列见表1。

表1 所选基因引物序列

1.4.3 Western Blot法检测各组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白水平：取出部分大鼠皮下组织，通过组织破碎仪加蛋白提取试剂提取总蛋白，将提取的蛋白加入十二烷基磺酸钠混匀后水煮变性。将提取的总蛋白进行电泳、封闭及转膜操作。转膜后分别孵育TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及β-actin抗体与相对应辣根过氧化物酶标记的二抗，洗膜显影，结果用ImageJ软件对各组细胞中不同因子的相对灰度值进行系统性分析。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血中炎症指标水平 ELISA结果如表2所示，造模后模型对照组与正常对照组相比，其血清TGF-β1、IL-8和TNF-α水平显著上升(P<0.05)，提示皮下蜂窝组织炎可使相关的炎症因子表达水平增加；与模型对照组相比，研究组大鼠血清中TGF-β1、IL-8和TNF-α水平显著降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠上皮组织TGF-β1、IL-8和TNF-α水平

2.2 各组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平 RT-PCR结果如图1所示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA水平均显著升高，Smad7的mRNA水平均明显降低(P<0.05)；与模型对照组相比，研究组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA水平均显著降低，Smad7水平显著上升(P<0.05)。

图1 各组大鼠脑皮质中EPO、VEGF的mRNA水平

2.3 各组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白变化水平 Western Blot结果如图2所示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白水平均显著升高，Smad7水平均明显降低(P<0.05)；与模型对照组相比，研究组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白水平均显著降低，Smad7水平显著上升 (P<0.05)。

图2 各组大鼠皮下组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达水平

3 讨论

急性皮下蜂窝组织炎最常见的症状为皮下组织炎性病变并化脓，其致病菌多为金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。这一类致病菌能够崩解基质与溶解纤维素并且由于皮下组织疏松及筋膜间隙较多，使得感染迅速蔓延，并伴有中性粒细胞与淋巴细胞浸润。如果没有得到及时有效的治疗用于控制病情，往往会导致病灶出现红肿热痛等情况。随着病情的持续发展，组织坏死形成囊肿，严重者甚至会导致脓毒血症及其他严重并发症，导致预后较差。因此合适的治疗方案是临床需要解决的问题，近些年中医药在临床诊治急性皮下蜂窝组织炎表现出了独特的优势[4-5]。

清肤消肿散是我院临床经验方，在明代经方的基础上结合现代中西医理论的创新，经过加减后配伍组成，方内主要成分为黄连、紫花地丁、栀子、蒲公英、连翘与金银花。前期临床使用显示，该药可能具有改善患者急性皮下蜂窝组织炎症状功效。本研究结果显示，当成功建立急性皮下蜂窝组织炎大鼠模型后大鼠外周血中炎症因子IL-8与TNF-α显著上升，与其他研究一致，且TGF-β1水平同样上升。当给予清肤消肿散治疗后，其炎症水平得到了显著改善，而且TGF-β1水平同样得到了降低。这可能与清肤消肿散方中成分效果有关。其中黄连和紫花地丁有苦泄、辛散，凉血消肿的效果[6]，能改善患处炎症水平；栀子、蒲公英、连翘和金银花分别发挥消肿止痛、凉血解毒[7-8]的效果；多药共奏清热凉血的作用，从而改善患者体内炎症水平及患处症状。此外，清肤消肿散是我院专家在明代经方基础上结合临床应用改良而来，效果显著。前期临床研究显示，在使用清肤消肿散治疗的患者中，其TGF-β1水平与症状严重程度呈正相关，与本研究结果一致。

TGF-β1/Smad 信号通路是一条经典的分子信号通路，研究表明，TGF-β1 的生物学效应主要通过Smad 家族蛋白发挥，主要包括该蛋白质家族中的受体调节型蛋白Smad2、Smad3和抑制型蛋白Smad 7型[9-10]。TGF-β1 经整合素、蛋白酶等机制激活后可与细胞表面的跨膜受体Ⅱ结合，并在磷酸化作用下活化 Smad2、Smad3蛋白，继而进一步诱导细胞外基质的合成[11]。但是，当 Smad7 上调并与跨膜受体Ⅰ结合时，Smad2、Smad3 活化会受到抑制[12]。本研究结果显示，当成功建立急性皮下蜂窝组织炎大鼠模型后，其皮下组织中TGF-β1与其下游受体调节蛋白Smad2、Smad3显著升高，抑制型蛋白Smad7显著降低，说明TGF-β1/Smad信号通路在这一过程中发挥着重要作用，而给予清肤消肿散治疗后能够明显拮抗这一效应，提示清肤消肿散能够通过TGF-β1/Smad信号通路发挥抗炎作用。

综上所述，本研究通过建立急性皮下蜂窝组织炎大鼠模型，并给予清肤消肿散治疗，能够显著改善大鼠炎症水平，这一过程很可能与抑制TGF-β1/Smad 信号通路有关。