循环肿瘤细胞的检测方法

宋宇航 杨小林 刘 康 宋桂芹

1.南充市中心医院 川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所，四川南充 637000；2.川北医学院基础医学院生物教研室，四川南充 637000

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是从肿瘤部位脱落的肿瘤细胞，在肿瘤发育过程中侵入外周血。其被认为携带着肿瘤发生、发展和转移的重要信息，与肿瘤转移密切相关[1]。CTCs 检测作为新兴的液体活检技术，具有取样方便、侵入性小、信息全面、无放射性污染、成本低等优势，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段之一，已成为当前癌症诊断领域的前沿热点[2]。由于外周血中CTCs的数量稀少，以及随着肿瘤转移CTCs 亚型不断变化，所以对CTCs 捕获及鉴定技术的研究是关键环节。旧技术的不断革新及新技术的不断挖掘，使得CTCs 的富集率进一步提高。本文简述了CTCs 的体内外检测方法，并分析了当前CTCs 检测面临的挑战及策略。

1 CTCs 的体外检测方法

CTCs 的富集方法是基于物理或生物特性的。前者取决于肿瘤细胞的尺寸、电性能等其他物理特性，而后者主要依赖于抗原抗体结合[3]。近年来，联合物理和生物特性检测的新型微流控芯片技术具有自动化、微型化、高通量、可集成下游分析等优点，在CTCs 检测分析中显示了巨大优势[2]。

1.1 基于物理特性的富集方法

研究表明，CTCs 比造血细胞更大、更硬[4]。基于这些物理特性的差异，已经开发了许多技术来提高CTCs 富集率[5]，其中膜过滤分离肿瘤细胞技术（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）系统是最早基于尺寸过滤的CTCs 分离的技术之一。在该系统中，血液被稀释，然后用8 μm 孔径过滤器过滤。CTCs 由于体积较大而被过滤器保留，红细胞和白细胞由于体积小于孔径而可以通过随机分布的孔。但由于CTCs和白细胞的大小重叠，依赖大小的过滤系统捕获目标细胞的效率有限[4]。因此，Sun 等[6]提出了一种增加细胞大小的策略，即在细胞过滤前利用修饰过的微珠来特异性结合CTCs，以提高捕获效率。使用该微流体捕捉系统以1 ml/min 的流速可以从全血样本中分离出高达91%的靶细胞[6]。

与ISET 系统类似，Screen Cell 系统通过使用微孔膜过滤器，通过筛孔大小分离CTCs[7]。该系统基于微过滤技术的过滤膜，可以使有核细胞通过，而CTCs被拦截。Screen Cell 系统具有高通量持续处理大量血液的潜力，并且具有相关的细胞和分子生物学技术，以及与CTCs 及其潜在基因异常的图形和鉴定相关的技术，可以方便地分析提取到过滤器上的肿瘤细胞[3]。此外，从血液中分离出来的细胞能最大程度地保存其活性和完整性，为CTCs 的体外培养奠定了基础。

流体辅助分离技术（fluid-assisted separation technique，FAST）是一种新型的离心微流控系统[8]。在这种方法中，基于尺寸的分离发生在离心微流控装置中的液-液界面上，而不是传统的液-气界面上。FAST 能够直接从全血中分离出高灵敏度、选择性、快速和无标记的CTCs，并且无需事先进行样本操作。

与血液中的白细胞比较，CTCs 具有更多的负电荷、更低的细胞质电导率及更高的单位膜电容[9]。介电泳场流分离技术采用的膜电容是基于细胞的大小和极化率，可以在30 min 内处理3000 万个细胞，回收率高[10]。但是其需要提前获知细胞的特定参数，如细胞类型和电场频率等。

1.2 基于生物特性的富集方法

Cell Search®系统是一种基于上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM）免疫检测的CTCs 富集方法，是目前食品药品监督管理局批准的第一种也是唯一一种用于结直肠、乳腺、前列腺等肿瘤的CTCs 检测方法[11]。Cell Search®系统的原理是由于EpCAM 在多种肿瘤细胞高表达，用磁珠标记的抗体特异性地结合这些抗原，随后通过施加磁场富集细胞[10]。然而Cell Search®系统无法检测出失去EpCAM 表达的细胞，而这些细胞通常在上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）期间产生[12]。EMT 对肿瘤细胞转移过程至关重要，这意味着使用该系统检测会漏检许多参与肿瘤转移的重要CTCs。由于Cell Search®系统仅适用于少数类型的癌症，且检测灵敏度不高，无法分离活的CTCs，因而较大程度地限制了其在临床检测中的有效应用[13]。

与Cell Search®系统类似，磁细胞分离（magnetic cell separation，MACS）利用涂有EpCAM 抗体的磁珠吸附表达EpCAM 的细胞。通过联合细胞角蛋白等标记可以提高CTCs 的检出率。同样地，MACS 无法检测到所有的CTCs，特别是那些缺乏上皮标志物的、具有高度恶性潜能的CTCs[14]。此外，使用MACS 富集与事先透化EpCAM 染色并不排除检出癌症相关巨噬细胞的可能性[14]。

1.3 微流控芯片技术

利用CTCs 的尺寸大于血细胞的物理特性及细胞表面标志物的表达差异，Ahmed 等[15]设计了DLD 式微柱阵列，并在微柱表面修饰抗EpCAM 抗体，进而构建了CTCs 高效率、高纯度富集的微流控芯片。根据DLD 原理，大尺寸的CTCs 会在微通道内不断与微柱碰撞并发生侧向位移，而小尺寸的血细胞则沿着层流水平前进不与柱子碰撞，选择性增强了CTCs 与微柱的碰撞概率。实验证明，在全血环境下，CTCs 的富集效率为（92.2±6.4）%，纯度高达（82.3±3.8）%[15]。

1.4 富集细胞鉴定

以上方法富集得到的CTCs 还需要后续实验进行检测鉴定，富集方式即使不同检测方法也可以相同[16]。目前CTCs 的鉴定方法有很多，其中最常用的是免疫荧光染色、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-PCR，RT-PCR）。

1.4.1 免疫荧光染色 固定富集的细胞后，用角蛋白荧光抗体（cytokeratin，CK）、抗CD45 和DAPI 等荧光染料标记对细胞进行免疫荧光染色，其中DAPI+/CK+/CD45-的细胞被鉴定为CTCs[17]。其优点是在荧光显微镜下可观测细胞蛋白表型及形态。缺点是蛋白标志物的表达缺乏稳定性，不能区分活细胞和死细胞[16]。

1.4.2 RT-PCR RT-PCR 可通过检测外周血中特定的逆转录DNA 片段来间接证实CTCs 的存在[18]。RTPCR 具有灵敏度高、可重复性好、无创等诸多优势[19]。但由于RT-PCR 只是从基因层面上鉴别CTCs，所以无活力的CTCs 在此方法中同时被鉴定出来。由于在细胞变形性分析和药物反应测定方面需要取活细胞，使其应用受限。

2 CTCs 的体内检测方法

在临床检查中，前述几种检测血液样本中CTCs的体外方法是基于一个基本假设，即外周血中CTCs计数不会随时间发生显著变化，但最近的研究对这一假设提出了挑战[20]。即CTCs 在循环中的分布可能不是均匀的，在给定时间点未检测到CTCs 的患者可能不是无CTCs[21]。但是，反复抽取患者血液以明确CTCs的时间分布是不现实的。因此，研究该问题的一个可行策略是通过体内检测方法监测CTCs。体内流式细胞术（in vivo flow cytometry，IVFC）能够以无创和连续的方式直接检测活动物模型中的移动细胞。根据原理不同，IVFC 可分为荧光IVFC 和光声流式细胞术（photoacoustic flow cytometry，PAFC）。

2.1 荧光IVFC

在使用荧光IVFC 检测CTCs 之前，需要对感兴趣的细胞进行标记。荧光IVFC 的基本原理与传统的流式细胞术相似，只是使用生物体内的天然血管代替常规流式细胞仪中的流动室[22]。当荧光标记的细胞通过聚焦在血管上的激光束的狭缝时，可以激发其发射荧光。荧光IVFC 可以在几分钟到几小时内连续测量最近标记的CTCs，并提供时间信息[23]。与体外检测CTCs 方法比较，荧光IVFC 不仅避免了抽血，还避免了体外检测方法中涉及的其他过程，如细胞裂解、离心和富集。这些体外过程会干扰CTCs 的生物环境，显著影响CTCs 检测的准确性。

2.2 PAFC

PAFC 利用CTCs 与血液背景的光吸收差异可以实现CTCs 在体检测[24]。其原理是使用高频脉冲激光照射血管，通过放置在组织表面的超声波探测器检测流经血管的靶细胞产生的瞬时超声波信号。当组织受到辐射时，目标细胞吸收光能，然后将光能转化为热能。这导致局部温度升高，引发组织的热弹性变化，产生超声波（即光声信号）。由于PAFC 是基于光吸收的对比，因此其只适用于特定吸收类型的细胞，如黑色素瘤细胞[22]。PAFC 不仅能实时检测体内黑色素瘤CTCs，还能消灭黑色素瘤细胞，具有显著的治疗效果[3]。

3 CTCs 检测面临的挑战及策略

3.1 CTCs 的稀缺性

研究表明[25]，肿瘤患者外周血中每毫升血液只有0～10 个CTCs，这对CTCs 富集设备的要求极为苛刻。越来越多的新方法使CTCs 的富集效率大大提高，新的标志物组合有效降低了假阳性率、假阴性率，但仍难以覆盖随疾病进展不断发生纵向变化的所有CTCs[26]。基于物理特性的富集方法具有免标记、高通量、不依赖细胞表面抗原表达水平等优势，但特异性差、富集效率和纯度低。基于生物特性的富集方法灵敏度高、特异性好，但成本高、耗时长。联合多种原理的富集方法各取所长、互补所短，能进一步提高富集效率。IVFC 虽然能在体内实时检测CTCs，但目前还停留在动物模型阶段，真正实现床旁监测还有很长的距离。发展具有更高灵敏度和特异性的CTCs 检测技术仍然是未来发展趋势。

3.2 CTCs 的异质性

肿瘤细胞的异质性是指同类肿瘤的瘤间，以及同一肿瘤组织的瘤内，存在形态、功能差异的癌细胞亚群[27]。对CTCs 而言，其异质性主要体现在细胞表面特征标志物种类及数量的动态变化，这将对设备的CTCs 捕获效率产生较大影响[28]。研究表明[29]，EMT 在CTCs 的生物学中起着至关重要的作用，并有助于CTCs的异质性。此外，EMT 不仅促进了CTCs 的扩散，而且在促进其从非干细胞进入干细胞状态方面发挥了关键作用[30]。对此，联合多种EMT 和干细胞标记鉴定CTCs 亚型不失为一种有效手段。对CTCs 亚型的深入认识是未来指导个体化、精准化医疗的关键环节。

4 现状及展望

作为一种新兴的诊断和治疗方法，CTCs 提供了在影像学方法使用前发现癌症的可能性，并结合其他肿瘤标志物指导治疗，监测患者术后治疗情况，预测患者预后。目前阻碍深入认识CTCs 的两个重要障碍仍然是其稀缺性与异质性。因此，发展具有更高灵敏度和特异性的检测技术是实现CTCs 精准捕获的第一步。对CTCs 亚型的深入认识则是未来指导个体化、精准化医疗的关键环节。尽管已经取得了很大的进展，但在以CTCs 为基础的液体活检广泛应用于临床应用的常规检测之前，还有很长的路要走。