蜂毒肽的抗炎作用及其不良反应

李修政，蒋剑敏，钱佳瑜，许晓东，董家潇，严佳栋

炎症是机体对外来刺激的一种自我防御反应，其起因包括外伤、感染以及影响体内稳态的污染物等，通常情况下是对人体有益的，但慢性炎症会导致风湿性关节炎、心血管疾病、炎性肠病、哮喘和中枢神经系统等相关疾病[1]。蜂毒肽（Mel）是蜂毒的主要成分，占其干重的 40% ～ 60%，由 26 个氨基酸残基组成（NH2GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2），分子式为C131H228N38O32，其中极性和非极性氨基酸残基分布不均匀，在折叠成 α-螺旋构型时产生蜂毒肽的两亲结构[2]。研究发现，高剂量蜂毒肽会引起瘙痒、发炎和局部疼痛等症状，而小剂量时则具有广泛的抗炎作用[3]。本文主要介绍蜂毒肽在抗炎中的应用以及存在的不良反应和目前的解决办法，以期为后续的研究提供理论依据和科学基础。

1 蜂毒肽的抗炎作用

1.1 抗关节炎作用

关节炎是影响关节和周围组织的慢性炎症疾病，目前发病机制尚不明确，现有的治疗方案虽然效果明显，但长期使用会产生严重的副作用。在哺乳动物中，NF-κB 家族由五名成员组成：Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel、NF-κB1（p50 及其前体 p105）和 NF-κB2（p52 及其前体 p100），它们形成多种同源二聚体和异二聚体，其中最普遍的活化形式是异二聚体 p65-p50[4]。Park 等[5]证明 Mel 可以直接与蛋白p50 结合，抑制 LPS 诱导的 p50 易位到核内，使炎症基因转录减少，最终导致 NF-κB 靶点失活。在后续的研究中，他们发现在小鼠巨噬细胞系和滑膜细胞中，Mel 与 IKK 信号通路相互作用可抑制 TNF-α/LPS 诱导的 NO 和 PGE2的产生[6]。类风湿关节炎（RA）可引起关节软骨和关节囊的破坏，导致关节强直畸形，而成纤维样滑膜细胞（FLS）的凋亡和自噬是 RA 病理生理学中的重要组成部分。He等[7]通过一系列的实验数据表明，Mel 能显著降低 RA-FLS的存活率，促进细胞凋亡和自噬，抑制 IL-1β 的分泌。该小组在先前的实验中就已证明 Mel 能调节胶原诱导 SD大鼠模型 Th17/Treg 的平衡，从而抑制关节的炎症[8]。18 只建模成功的大鼠，分为模型组、蜂毒肽组、甲氨蝶呤组，第14 天分别注射灭菌水、蜂毒肽（0.5 mg/kg）和甲氨蝶呤（1 mg/只），32 天后麻醉处死，观察血清中 TNF-α、IL-10、IL-17 A 浓度变化。结果显示，Mel、甲氨蝶呤均可抑制炎症因子产生，延缓骨骼破坏。

1.2 抗动脉粥样硬化作用

动脉粥样硬化（AS）是一种由脂质、单核细胞和动脉壁细胞之间的相互作用引起的慢性动脉炎性疾病，血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和凋亡在 AS 病变的进展中起重要作用，并且认为 NF-κB 信号传导的调节在细胞凋亡和增殖中起关键作用，是治疗 AS 的潜在靶点[9-10]。Son 等[11-12]研究了 NF-κB 信号通路作为培养大鼠主动脉 VSMC 细胞凋亡的有效机制，发现 Mel 不仅抑制血小板衍生生长因子受体（PDGFR）β-酪氨酸磷酸化，还抑制大鼠主动脉VSMC 中下游的细胞内信号转导并阻断 PDGFR 信号传导中的 AKT 磷酸化。此外，Mel 可以诱导促凋亡蛋白 p53、Bax 和 caspase-3 等的表达，但会降低抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达。体内实验表明，Mel 通过降低 AS 小鼠中 TNF-α、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1 和 TGFβ-1 的表达，达到降低总胆固醇和甘油三酯水平的目的。Cho 等[13]通过 Mel 处理TNF-α 刺激的人 VSMC，用质谱和凝胶电泳来检测蛋白质的表达差异，鉴定了 33 种在 Mel 处理后具有不同表达模式的蛋白质，包括抗凋亡蛋白（如 stress-70 蛋白）和膜联蛋白 A1，并鉴定出几种炎症和增殖的靶标，如抑制素、膜联蛋白 1 和钙网蛋白等。进一步通过细胞内信号通路分析，表明 EGFR 和 NF-κB 是 TNF-α 处理的人 VSMC炎症的主要信号分子，有助于阐明 Mel 的抗动脉粥样硬化机制。

1.3 抗皮炎作用

痤疮丙酸杆菌是皮肤痤疮发生的主要原因，其致病机制是激活 Toll 样受体 2 信号转导，使角质形成细胞和单核细胞，从而分泌促炎性因子，包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-8[14]。Lee 等[15]研究了蜂毒肽对热灭活的痤疮丙酸杆菌诱导的HaCaT 细胞反应，在灭活痤疮丙酸杆菌处理的 HaCaT 细胞中加入 Mel，减弱了 IKK、IκB、NF-κB 的产生并增加p38 磷酸化，这表明 Mel 可以阻断 HaCaT 细胞中 NF-κB和 p38 MAPK 信号传导来消除痤疮丙酸杆菌诱导的炎症细胞因子的产生。在动物模型中验证了这一机制，经痤疮丙酸杆菌处理的小鼠耳朵在注射 Mel 时，肿胀和肉芽肿反应明显减少。该小组在另一项研究中表明，Mel 对热杀死的痤疮丙酸杆菌诱导的人 THP-1 单核细胞炎症中具有抑制作用[16]。除对痤疮性皮炎有显著作用外，Mel 对特应性皮炎也有治疗作用。特应性皮炎俗称特应性湿疹，表现为瘙痒、皮肤干燥、免疫反应异常以及免疫球蛋白 IgE 介导的对各种外源抗原的过敏。An 等[17]从特应性皮炎模型中证实，Mel 对 1-氯-2,4-二硝基苯（DNCB）诱导的体内和肿瘤坏死因子（TNF）-α/IFN-γ 诱导的体外均存在药理作用，Mel 具有强大的抗异位活性，使 DNCB 诱导的特应性皮炎样皮肤损伤减少。在使用 TNF-α/IFN-γ 刺激的人角质形成细胞的体外研究表明，Mel 通过阻断 NF-κB 和 STAT 信号通路，从而抑制趋化因子（TARC/CCL17、MDC/CCL22）和促炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ 等）的表达。Kim 等[18]发现 Mel 对小鼠卵清蛋白引起的特应性皮炎具有治疗作用，即将 Mel 用来处理卵清蛋白（OVA）贴片诱导的特应性皮炎，发现小鼠皮肤增厚和炎性浸润明显减轻。此外，Mel 还可以通过阻断 STAT3 的激活，从而抑制 IL-4/IL-13诱导的人角质形成细胞微丝蛋白表达下调。

1.4 神经退行性疾病的应用

神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍，包括帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）以及肌萎缩性侧索硬化症（ALS）等[19-20]。体外研究表明，Mel 对 H2O2诱导的神经母细胞瘤 SH-SY5Y 的细胞凋亡具有神经保护作用，经 H2O2处理的细胞活力降低，caspase-3 的产量增加，而 Mel 的参与增加了细胞活力并减少了凋亡细胞的 DNA 片段化，减弱H2O2诱导的抗凋亡因子 Bcl-2 的表达[21]。Mel 还通过阻断LPS 诱导的 BV2 小胶质细胞系中 NF-κB 的活化而抑制NO 和 iNOS 的表达，表明 Mel 对 BV2 小胶质细胞的促炎症反应有抑制作用，可以作为治疗伴小胶质细胞激活的神经退行性疾病（例如 PD）的潜在药物[22]。Yang 等[23]研究了 Mel 在小胶质转基因小鼠模型中对 ALS 的治疗效果，发现经 Mel 治疗的动物可以激活脑干和脊髓中的小胶质数量，降低促炎症因子 TNF-α 的表达，从而抑制脊髓中神经元减少，改善运动功能。尽管 ALS 的主要问题是发生在中枢神经系统中，但 ALS 还影响其他器官，包括肝脏、脾脏和肺，Mel 治疗可减轻 ALS 动物模型中的炎症并刺激脾脏和肺细胞存活的信号传导[24]。此外，Mel 通过激活分子伴侣和减轻 α-突触核蛋白转录后的修饰来调节错误折叠蛋白的产生，这也是 PD 和 ALS 病症的一个重要机制[25]。除以上作用外，Mel 在处理 ALS 引起的其他器官的问题也具有显著的效果，在减轻炎症的同时刺激 ALS 动物模型中脾脏和肺细胞存活的信号传导，并抑制有症状 ALS 转基因小鼠肺中 CD14 和炎症蛋白 Iba-1 的表达。

1.5 其他

Mel 作为一种天然肽具有多种药理活性，目前已知在肝炎、结肠炎等方面也具有潜在药用价值。Park 等[26]发现Mel 可减轻肝损伤、炎症和肝纤维化，抑制 TNF-α 处理的肝星状细胞（HSC）中的 TNF-α 分泌以及 IL-1β 和 IL-6的表达。在 TNF-α 处理的肝细胞中，Mel 抑制 NF-κB 的DNA 结合以及 NF-κB 的启动子活性，表明 Mel 通过抑制NF-κB 活化来抑制肝细胞凋亡。该组还证明了 Mel 可以阻断 D-半乳糖胺和 LPS 诱导的小鼠肝衰竭模型中的 NF-κB信号传导和凋亡途径，从而来抑制肝衰竭[27]，降低高致死率，减轻肝病理损伤和肝功能炎症反应并抑制肝细胞的凋亡。Ahmedy 等[28]发现 Mel 可以减轻 TLR4/TRAF6 介导的 NF-κB 和 p38MAPK 信号通路，在醋酸诱导的溃疡性结肠炎中起抗溃疡作用。以低剂量（40 mg/kg）作为对照，Mel 组表现出明显改善醋酸引起的组织学损伤作用，有效抑制 TNF-α 和 IL-6 含量升高，并且减弱醋酸诱导的氧化应激。Mel 对完全弗氏佐剂诱导（CFA）的慢性前列腺炎大鼠模型也具有显著作用，前列腺内注射 CFA 可引起局部痛觉敏感，持续时间至少 2 周以上。前列腺中 COX-2和脊髓中 GFAP 的表达也升高。Mel 治疗可显著提高痛阈，减少炎症浸润，抑制 COX-2 和 GFAP 的表达[29]。除上述药理作用外，Mel 还可以激活 HDAC2 介导的GSK-3b/Nrf2/ARE 信号通路，改善 CVB3 诱导的心肌炎，但由于副作用明显，用于临床还需要进一步探讨[30]。

2 不良反应及应对策略

Mel 是蜂毒的主要成分，被称为致敏肽，其安全性仍是限制临床应用的主要因素。在一项 Meta 分析中对 145 项研究进行分析，有 58 项研究发生了不良事件[31]。Mel 的应用可能会引起免疫系统反应、局部反应、超敏反应、皮肤问题和非特异性反应等，给药频率和剂量是目前导致严重不良反应的直接原因，具体机制需要进一步研究[32-33]。

2.1 溶血、细胞毒反应

早在 1972年，就已确认 Mel 具有溶血活性[34]。Mel的天然靶标是含有大量胆固醇（45%）的红细胞膜，在亚微摩尔浓度下，以剂量和时间依赖性方式对人外周血淋巴细胞（HPBL）具有细胞毒性，当 Mel 引起溶血时，增加了离子的渗透性，当阳离子从细胞膜排出后，红细胞出现肿胀并释放血红蛋白[35-36]。Raghuraman 和 Chattopadhyay[37]在胆固醇对 Mel 的溶血活性研究中发现，使用甲基-β-环糊精（MβCD）对大鼠红细胞中的胆固醇进行特异性消耗，当胆固醇减少 55% 时，Mel 的溶血作用增强了约 3 倍，并且没有任何明显的磷脂损失，表明胆固醇与 Mel 溶血能力强弱密切相关。

2.2 超敏反应

蜂毒组成复杂，包括蜂毒素、谷氨酰胺、肥大细胞脱粒肽、组胺、阿托拉品、寡肽、磷脂、糖、磷酸脂酶 A2、透明质酸酶、酸性磷酸酯酶等。20世纪70年代，Paull等[38]发现蜂毒肽可在约三分之一患者当中诱导 IgE 反应，推测是蜂毒肽纯度不高所致。纯化的蜂毒肽可能含有强过敏原的残基，目前市售蜂毒肽常含有透明质酸酶、磷酸脂酶 A2 和酸性磷酸酯酶等。近年来主要通过放射性过敏原吸附试验（RAST）检测特异性 IgE 抗体，已证实蜂毒肽是高度纯化制剂中的过敏原，致敏率为 22.9% ～ 29%[39]。

2.3 遗传毒性

Gajski 等[35]发现蜂毒肽以剂量和时间依赖性方式对人外周血淋巴细胞（HPBLs）具有细胞毒性，并诱导细胞形态改变，肉芽形成和裂解。在使用非细胞毒性浓度的蜂毒肽处理 HPBLs 后，DNA 损伤加剧，除此之外，Mel 还参与调节细胞凋亡（Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-7）、DNA 损伤相关的基因表达（TP53、CDKN1A、GADD45α、MDM）和氧化应激（CAT、GCLC、GPX1、GSR、SOD1）等。研究表明，遗传毒性与谷胱甘肽水平的降低、活性氧物质的形成增加、磷脂酶 C 活性和脂质过氧化作用增加一致，显示出氧化应激的诱导作用[40]。

2.4 应对策略

蜂毒肽在抗炎方面的广泛用途越来越引起科研人员的关注，但其明确的毒副作用限制了临床的进一步应用。针对此类肽的缺点，目前研究人员致力于从结构修饰、载体递送和融合蛋白等方面来减少毒性，增加疗效。Wu 等[41]受到全碳氢交联订书肽启发，将该系统用于蜂毒肽中，得到一系列蜂毒肽衍生物，与蜂毒肽相比，该类衍生物可明显降低蜂毒肽的溶血活性并增加细胞穿透性，达到合理的蛋白酶稳定水平。Gui 等[42]开发了一种聚电解质的纳米复合系统，其中带正电的门控调节毒素（GMT）和带负电的葡聚糖硫酸盐（DS）之间形成强相互作用，该系统可以延长蜂毒肽释放，降低急性毒性和增加给药效率。李亚巍[43]构建的 Mel@ZIF纳米载药体系在高出 Mel 单体十几倍浓度的时候仅具有8% 的溶血活性，并且能减少对正常组织细胞的非特异性细胞毒性。除以上方法外，通过蛋白融合途径也表现出较满意的结果。Rayahin 等[44]发现 Mel 和谷胱甘肽 S-转移酶融合可以使其毒性降低，并且在超过天然蜂毒浓度下仍保留抗炎特性，这种方法可作为蜂毒肽的无毒替代品。

3 展望

经过数十年的努力，国内外研究人员发现 Mel 在多领域具有确切的生物学作用，包括抗炎、抗癌、抗菌和抗病毒等。本文总结了 Mel 在抗炎方面的应用以及易发生的不良反应和部分解决方案，但对于 Mel的具体作用机制和不良反应尚不能提供满意的解决方案，需要进一步研究。目前Mel 在炎性疾病的临床应用还需要新的研究策略，包括发展新的递送系统、结构修饰和多方式联合给药等。我国具有丰富的蜂毒资源和众多炎性疾病患者，Mel 的研究具有广阔的前景和开发价值，期待高效低毒的 Mel 药物尽快投入临床。