非编码RNA在胆管癌相关信号通路中的研究进展

毛俊，瞿巧莉，曾珍，仁赵玲，胡莹

胆管上皮癌（cholangiocarcinoma，CCA）属于罕见的恶性肿瘤，主要由胆管上皮细胞癌变而来，相关数据显示，恶性肿瘤中 CCA 仅占 2%，发病率却在逐渐升高[1]。据调查研究，在 2000 - 2015年期间，CCA 在美国的发病率和死亡率呈上升趋势[2]。不仅如此，其发病率在其他地区大多数国家同样有所增加[3]。CCA 根据病变解剖位置，分成肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICCA）和肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma，ECCA）[1,4]。目前，诊断 CCA 通常采取实验室检查，影像学检查和组织活检等[5]，缺乏早期特异性标志物。故通常在晚期发现，即使行手术切除，预后也不乐观。

非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不编码蛋白质，但能从基因转录组上转录而来的 RNA。包括微小RNA（micro RNA，miRNA）和长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等。有研究表明，ncRNA 可以充当癌症的致癌驱动因子或肿瘤抑制因子，通过多种信号通路参与肿瘤的进展或抑制[6]。本文将重点介绍 ncRNA 通过某些信号通路促进或抑制 CCA 进程的研究进展。

1 ncRNA 与 CCA 相关信号通路

1.1 Hedgehog 信号通路

Hedgehog（hh）信号通路与肿瘤生成息息相关，其中Sonic hedgehog（Shh）是 hh 蛋白中研究最为广泛的，其激活主要通过典型信号传导（依赖 GLI）和非典型信号传导（不依赖 GLI）[7]。早期研究就已经证明 Shh 信号通路在胆管癌中激活并发挥重要作用，如 Riedlinger 等[8]通过分析50 例人胆管细胞癌样本中 PTCH1、GLI1 和 Shh 的基因表达，发现 hh 信号通路成分 GLI1、PTCH1 以及 Shh 在胆管癌样本中过表达，使用 hh 信号通路抑制剂后 CCA 细胞增殖显著减少。但该研究仅针对 CCA 细胞的增殖，而未涉及入侵和迁徙能力，具有一定局限性。El Khatib 等[9]、Tang 等[10]和 Bhuria 等[11]则进一步发现激活 Shh 通路能启动 CCA 的 EMT 过程，增加 CCA 细胞入侵和迁徙能力，弥补了先前的不足。随着研究的深入，学者发现一些lncRNA 在很多癌症相关疾病中常呈高水平，并能调控 hh信号传导，下调其水平能显著减弱 CCA 的恶性表型。如Guo 等[12]研究发现 ASAP1-IT1 是一种具有致癌作用的lncRNA，敲除或沉默 ASAP1-IT1 会导致 CCA 细胞增殖、迁移和 EMT 的减弱。且 smo1 和 GLI1 蛋白水平会由于ASAP1-IT1 在胆管癌细胞中表达下调而下调，致 hh 信号通路关闭，延缓 CCA 进程。这些研究均表明 hh 信号通路和某些 lncRNA 能够促进 CCA 的进展，抑制 hh 信号通路的激活及下调相关 lncRNA 的水平是潜在的治疗靶点。

1.2 Hippo 信号通路

Hippo 信号通路在肿瘤的信号传导、代谢调节以及发生发展里面扮演着不可忽视的角色[13]，主要通过其核心激酶链发挥效应，包括 MOB1、LATS1/2、SAV1 和 MST1/2。当通路处于激活状态，磷酸化 MOB1 及 LATS1/2 作用于下游效应因子 YAP/TAZ，使其在细胞质停留，致下游基因的表达被阻碍。当通路处于关闭状态，YAP 在核内激活并诱导下游基因的表达[14]。Hippo 信号传导能够把控细胞生长和凋亡，参与 CCA 的恶性进展，且与患者的预后密切相关。研究表明在总体生存率上，高 YAP1 的比低 YAP1 差，低 MOB1 低于高 MOB1，且进一步分组发现 YAP1 低水平/MOB1 高水平组明显高于其他 3 组[15]。提示 YAP1 可能发挥癌基因效应且高水平，MOB1 作为抑癌基因低水平，引起 Hippo 信号改变导致 ICCA 患者预后不良，但对于此通路的上游调控基因尚未涉及。而 lncRNA 与 CCA 在内的许多肿瘤的发展密不可分，且已证明能通过调控 Hippo信号传导增加肿瘤的生长和入侵。如 Li 等[16]发现 lncRNA MNX1-AS1 在 ICCA 细胞系和组织中水平升高，在体外能增强 ICCA 细胞的扩散、侵入能力和血管生成。且主要通过 c-myc 和 MAZ 来增强 MNX1 蛋白的表达，随后促进AJUBA 蛋白水平升高从而抑制 Hippo 通路的活性，导致核内 YAP1 蛋白的增加，促使 ICCA 的发生和发展。

1.3 MAPK 信号通路

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）包括 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK 和细胞外信号调节激酶（ERK），在细胞生物代谢、增殖还有分化方面意义非凡[17]，其异常调节在许多癌症中被证明广泛存在。已有研究表明，miRNA 与 MAPK 信号通路串扰在肿瘤各个环节：细胞的增殖、迁移[18]。并且 miRNA 能够下调下游基因的水平从而阻断 MAPK 信号传导，延缓CCA 进展。例如，Hu 等[19]发现 PTTG1 是 miRNA-329 的靶基因，并且 miRNA-329 能够通过抑制 PTTG1 的表达下调 p38 和 ERK5 的磷酸化程度，致 MAPK 信号传导被阻断，细胞周期停滞，肿瘤生长扩散受到阻碍，凋亡增加。但也有研究报道 miRNA 会受其他 ncRNA 的调控，使其抑制作用减弱甚至消失。如 Kong 等[20]研究发现 miRNA-122能抑制 ERK/MAPK 蛋白的磷酸化，使这条通路失活。但lncRNA-UCA1 可以充当 miRNA-122 的 ceRNA，抑制miRNA-122 而上调 miRNA-122 下游靶标基因 CLIC1 的表达，ERK/MAPK 信号传导得以激活，CCA 侵入能力及转移增强。

由此看来，一些 miRNA 在 CCA 中充当抑癌基因，能阻断 MAPK 信号通路发挥抑癌效应，但它们同样会因受到其他 ncRNA 的调控而作用减弱。因此，提高相关miRNA 水平并切断其他 ncRNA 对它们的调控或许是一种潜在的治疗手段。

1.4 mTOR 信号通路

哺乳动物雷帕霉素靶标（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Th）蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶（PIKK）家族，对细胞代谢、生长、增殖、存活和自噬等生物学行为具有重要作用[21]。许多癌症这条通路异常活化，使癌细胞处于高代谢、高增殖和永生等状态。研究表明 lncRNA 在 CCA 中高水平且能增强 mTOR 通路活性以增加 CCA 的恶性行为，敲除相关 lncRNA 或能成为一种潜在的治疗靶点。如最近的一项研究发现在 ICCA 中，lncRNA-HAGLROS 水平升高，与预后成负相关，敲除 HAGLROS 的 ICCA 细胞系QBC939 细胞其脂质相关指标 TG、LDL-C 和TC 水平显著降低，而 HDL-C 升高。且脂质代谢相关基因水平降低，并使 mTOR 轴失活和自噬增加，改善了 ICCA 中的脂质代谢重编程，抑制了 ICCA 细胞活力[22]。除敲除 lncRNA 外，研究表明增加抑癌基因 miRNA 的表达来阻断 mTOR 通路从而增加 CCA 对其他药物的敏感性或许也是一种潜在的治疗手段。如 Li 等[23]研究发现 miRNA-199a-3p 的表达与顺铂敏感性呈正相关。在顺铂作用下，miRNA-199a-3p 过表达可降低 CCA 细胞的增殖率，增加细胞凋亡，且可失活mTOR 信号通路来减少多重耐药性基因 1（multiple drug resistance1，MDR1）的合成和增加 MDR1 的降解来降低顺铂诱导的 MDR1 的表达，从而增加 CCA 顺铂敏感性，提高顺铂治疗胆管癌的疗效。

1.5 NF-κB 信号通路

核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）掌握着细胞生命的关键密码，其信号异常参与了大多数人类恶性肿瘤的发病过程，主要是将抗凋亡基因表达上调，使癌细胞免于凋亡[24]。已有研究表明 lncRNA 能够作为癌基因并通过ceRNA 机制降低 miRNA 的水平从而增高 NF-κB 通路活性促进 CCA 恶性进展。如 Li 等[25]发现 lncRNA-SNHG1在 CCA 细胞系中上调，且以 miRNA-140 为直接靶标，通过抑制这个 miRNA 的表达来增强 Toll 样受体 4（toll-like receptor 4，TLR4）和 NF-κB p65 蛋白表达，从而使 NF-κB信号通路得以激活，以促进 CCA 的进展。因此，治疗 CCA可考虑以阻碍这条通路为重要手段，研究更多针对 NF-κB的失活剂或者通过敲除、沉默相关 lncRNA 以破坏 ceRNA机制，使 NF-κB 传导失活是理论可行的。

1.6 Notch 信号通路

Notch 级联反应存在四种受体（Notch1、2、3、4），参与了细胞间的信息交流，能对细胞的生长、分化和灭亡进行调节，因此在癌症相关疾病中处于非正常调控[26]。两个不同团队均发现了 Notch1 在人 ICCA 细胞系或组织中过表达，并且能够增强 ICCA 的增殖和侵袭[27-28]。此外，ncRNA能够控制 Notch 信号通路的激活与关闭以调控肿瘤的发展[29]。例如，Kwon 等[30]研究表明 miRNA-34a 水平在CCA 细胞下调，提高 miRNA-34a 水平能够阻碍 CCA 细胞的扩散和肿瘤的生长，且 miRNA-34a 是以 Notch 信号通路为靶标，阻断 Notch 信号传导来阻碍 CCA 细胞的扩散。因此，Notch 通路可增加 CCA 的恶性表型，直接通过失活剂或者调控某些 miRNA 的表达使 Notch 信号传导中断以控制 CCA 的进展是一种治疗前景。

1.7 PI3K/AKT 信号通路

磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶-B（PI3K/AKT）信号通路对细胞的生长、分化和代谢具有调节作用，在肿瘤中常常被过度激活，且通常伴随着肿瘤抑制基因 PTEN 的失活[31]。例如在胆管癌研究中，黄利勇等[32]通过分析 47 例胆管癌标本，发现 PI3K、AKT 水平升高，PTEN 水平下降，提示 PI3K/AKT 传导途径在 CCA 中被激活。此外，有学者报道 lncRNA 可作为癌基因或抑癌基因通过调控此通路的激活与否来加快或阻碍肿瘤的恶性进展[33]。如 Wei 等[34]发现 lncRNA SOX2-OT 在胆管癌组织及 CCA 细胞中水平升高，增强了 CCA 细胞的生长和扩散，且能抑制 PTEN的表达，激活 PI3K/AKT 传导途径，CCA 恶性表型增加。由此可见，沉默或敲除相关 lncRNA 阻碍 PI3K/AKT 的传导途径或能成为潜在的治疗手段。鉴于此，有研究报道，lncRNA-MALAT1 在 CCA 细胞中水平升高，沉默这个基因则阻碍了 CCA 细胞系（QBC-939 和 RBE）的扩散和侵入能力，减弱了 EMT，且 PI3K 和 AKT 蛋白的磷酸化能通过敲除 MALAT1 而减少，使 PI3K/AKT 因子活化受阻，PI3K/AKT 传导途径中断，CCA 进程延缓[35]。此外，也有相关研究报道 miRNA 可抑制这条通路，从而发挥抑制剂效应，成为治疗 CCA 的一种手段。如 miRNA-885-5p 在ICCA 组织中水平异常下降，提高 miRNA-885-5p 水平减弱了 ICCA 细胞系的迁徙和侵入能力，并可调低 GALNT3水平而下调 PI3K/AKT 信号通路，减少 ICCA 扩散[36]。

1.8 TGFβ 信号通路

转化生长因子 β（transforming growth factor beta，TGFβ）信号通路被认为是生物体内的一条重要通路，能够调控生物细胞的生长、分化和细胞周期，其信号传递可通过活化下游的 Smad 蛋白，从而诱导它在核内聚集并作为转录因子发挥效应[37]。在肿瘤相关疾病，TGFβ 可作为效应因子，使肿瘤迁移和入侵能力提高，EMT 加强[38]。例如 Huang等[39]通过建立大鼠模型，用短发夹核糖核酸（shRNA）或药物抑制 TGFβ1 的活性结果抑制了 CCA 的增殖和迁移，过表达则能促进 CCA 的增殖和迁移，并且这种作用是通过miRNA-34a 介导的。提示 miRNA-34a 在 CCA 中可能发挥这条通路的抑制剂作用。另一项研究证明了这个观点。他们发现 miRNA-34a 在 ECCA 组织和细胞系中呈低水平，Smad4 是 miRNA-34a 的直接靶标，且 miRNA-34a 在体外能拮抗 Smad4 介导的 TGFβ 信号通路诱导的 EMT，使CCA 的入侵和扩散削减[40]。总之，通过调节 miRNA-34a 的表达下调 TGFβ 信号通路可成为抑制 CCA 恶性转移的一种可行方法。

1.9 Wnt 信号通路

Wnt 信号通路被认为是生物体内特别保守的信号传导途径，能调节细胞的生长、极性和凋亡，包括经典 Wnt 信号通路（依赖 β-catenin）和非经典 Wnt 信号通路（不依赖β-catenin）[41]。在肿瘤相关疾病，Wnt 传导途径能使肿瘤细胞的生长、入侵能力和 EMT 得到提高[42]。Zhang 等[43]发现 Wnt、β-catenin 在 CCA 细胞中高表达，敲除 Wnt2 或β-catenin，阻断 Wnt 传导，可明显阻碍细胞生长，增强凋亡。同样有报道称 lncRNA 能作为致癌基因，激活 Wnt传导而加快 CCA 发生发展。Zhang 等[44]实验显示lncRNA-PCAT1 在 ECCA 肿瘤标本和细胞中呈高水平，且可作为 miRNA-122 的 ceRNA，使 miRNA-122 水平降低致 Wnt1 的表达增高，加快 ECCA 细胞的生长和入侵，抑制凋亡，激活 Wnt/β-catenin 传导，从而促进 ECCA 进展。但他们的实验基于体外进行，并未进行动物模型的体内验证，实验结果具有一定的局限性。与此相反，最近一项研究表明 lncRNA 在 CCA 中也能作为抑癌基因抑制Wnt 信号通路。Hu 等[45]研究显示 LncRNA-MIR22HG 在 CCA病理标本和细胞系中水平低，上调能够阻碍 CCA 细胞的扩散及侵入，显著降低了 β-catenin、cyclinD1 和 c-myc 蛋白水平和 mRNA 的表达，加入外源激动剂 SKL2001 显著减缓了 MIR22HG 上调诱导的细胞扩散及侵入的抑制作用，表明 MIR22HG 通过负性调控 Wnt/β-catenin 传导途径来阻碍 CCA 恶性进程。

1.10 多信号通路互作

在 CCA 中，多种通路传导存在异常，且这些信号通路并非各司其职，互不关联，而是存在协同关系，共同增强CCA 细胞的迁徙和增殖能力。最近一项研究报道，lncRNA NNT-AS1 在 CCA 细胞及组织中高水平，且以 miRNA-203为靶标，使其水平下调致 PI3K/AKT 和 ERK1/2 信号通路活化，最终使 CCA 细胞（CCLP1 和 TFK1 细胞）增殖和EMT 增加[46]。表明 PI3K/AKT 信号通路和 MAPK 中的ERK 信号通路在 CCA 细胞的增殖和 EMT 中具有协同效应并且都可由 lncRNA NNT-AS1 和 miRNA-203 调控。此外，Kwon 等[30]、Huang 等[39]和 Qiao 等[40]分别发现了miRNA-34a 能阻碍 Notch 和 TGFβ 信号传导，但他们仅单独研究了其中一条通路，我们推测 Notch 和 TGFβ 信号通路在 CCA 中具有协同关系，共同增强 CCA 细胞的迁徙和侵入能力，且都能被 miRNA-34a 抑制。但目前还未有相关报道，需进一步开展实验研究。

2 问题与展望

目前，对于 ncRNA 调控 CCA 相关信号通路的研究越来越多，但仍有许多研究仅仅基于细胞和实验动物层面，并未对临床 CCA 组织标本进行分析。而涉及 CCA 组织方面的实验也还未报道单独针对早期胆管癌的研究。有研究报道ncRNA 的表达量与肿瘤临床分期、TNM 分期都具有统计学差异。因此，早期胆管癌中是否存在特异性高并参与调控相关信号通路的 ncRNA 是我们需要思考的问题。单独对早期胆管癌进行研究，并比较不同 ncRNA 的特异度，对早期诊断及治疗胆管癌具有重要意义。此外，对于已发现的ncRNA 及其调控的信号通路应进行深入研究，比较它们单独之间及联合应用的疗效，并进行临床试验，验证临床治疗的可行性。相信随着科学迷雾的不断拨开，胆管癌的诊疗会开创新的天地。