单细胞测序技术在淋巴瘤中的应用研究进展

司君齐，袁田，李世俊，田晨，△

单细胞测序（single cell sequencing，SCS）技术是在单个细胞水平上对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。相较于代表一群细胞平均基因表达水平的传统测序，如大量RNA 测序（bulk RNA-seq）［1-2］，SCS 能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性［3］。SCS通过检测单个细胞基因组与转录组的差异，进而对其聚类，可鉴定出传统测序技术检测不到的罕见或新型细胞亚群。近年来，随着测序成本的降低，SCS技术越来越受到关注，特别是在血液肿瘤研究方面。本文就近几年SCS技术在淋巴瘤研究中的应用进展进行综述，旨在为淋巴瘤的基础研究提供新的思路。

1 SCS技术的基本原理

对于多细胞生物来说，不同组织细胞的基因表达往往具有显著差异，即便是来源于同一组织，其组织内部各个细胞的异质性也很显著，而肿瘤内存在的异质性是患者对抗肿瘤药物耐药的原因之一，这与其预后不良相关，是目前肿瘤治疗面临的巨大挑战［4-6］。SCS技术则可全面而精确地分析肿瘤细胞基因组、转录组和表观组，在单个细胞水平上对基因组或转录组进行扩增并测序，以检测单核苷酸位点变异、基因拷贝数变异、单细胞基因组结构变异、基因表达水平、基因融合、单细胞转录组的选择性剪切及单细胞表观基因组的DNA 甲基化状态等［7-8］。SCS主要包括以下几个步骤：（1）标本采集。（2）单细胞悬液制备。（3）单细胞捕获。（4）文库构建。（5）测序。（6）生物信息学和统计分析［9-10］。

2 SCS技术的分类

SCS 包括一组功能强大且全面的技术，在过去的几年中，已经开发了多种SCS方法，包括全外显子组测序（scWES）、全转录组测序（scRNA-seq）、全基因组测序（scWGS）、全DNA 甲基化测序（scM-seq）、单细胞V（D）J 测序、转座酶可接近性核染色质区域测序（scATAC-seq）等［11］，上述测序方法各具特点和优势，可以从不同维度、不同层面获得不同阶段的细胞特征性信息。scWGS可用于单核苷酸变异和拷贝数异常的筛选；scATAC-seq主要用于分析单个细胞染色质可及性［12-13］；scRNA-seq 代表了目前最成熟的SCS 方法，可用于细胞类型鉴定、细胞状态分析、基因标记、通路分析、表达亚型分析、肿瘤谱系推断和细胞类型特异性差异表达分析等［14-15］。

3 SCS技术在淋巴瘤中的应用

3.1 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL） HL是一种来源于B 淋巴细胞的罕见肿瘤，由肿瘤细胞与大量非肿瘤炎性细胞和（或）纤维化组织混合构成［16-17］。其主要分为2大类：经典型HL以及结节性淋巴细胞为主型HL［18］。Aoki 等［19］对来自22 个HL患者淋巴结活检标本和5个反应性淋巴结切检标本的超过12.7 万个细胞进行了scRNA-seq，首次在单细胞尺度下描绘了HL 特异性免疫微环境的表型。该研究利用单细胞表达谱鉴定出一种新的HL 相关调节性T 细胞亚群，该亚群高表达抑制性受体LAG3，功能分析证实这种LAG3+T 细胞是免疫抑制的中介；进一步对微环境中免疫细胞的多重空间评估也显示，主要组织相容性复合体Ⅱ类基因（MHC-Ⅱ）表达缺失的肿瘤细胞附近LAG3+T 细胞增加，MHC-Ⅱ是LAG3 的主要配体之一，通过MHC-Ⅱ和LAG3的相互作用，使得LAG3+T细胞受到负性调控。该研究结果有助于探索HL 肿瘤微环境及免疫逃逸机制、研发靶向治疗药物。

3.2 非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）

3.2.1 T细胞淋巴瘤 T细胞淋巴瘤占NHL的10%~15%。成熟（胸腺后或外周）T 细胞起源的肿瘤统称为外周T 细胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）。T 细胞淋巴瘤主要包括间变大细胞淋巴瘤（anaplastic cell lymphoma，ALCL）、皮肤T 细胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma，CTCL）、辅助性滤泡T细胞淋巴瘤（helper follicular T cell lymphoma，TFH）以及肠病相关T 细胞淋巴瘤（enteropathy-associated T cell lymphoma，EATL）等［18］。Borcherding 等［20］对1例Sézary综合征患者的恶性和非恶性CD4+细胞进行scRNA-seq 和单细胞V（D）J 测序分析后发现，FOXP3+T细胞可转化为GATA3+或IKZF2+（HELIOS）肿瘤细胞，从而参与克隆演化过程。Sézary 综合征是CTCL 的一种特殊亚型，因此，FOXP3被认为是预测CTCL 早期和晚期疾病状态的重要因素。在另一项研究中，Gaydosik 等［21］对5例CTCL 晚期患者和4例健康捐赠者的14 056 个CD3+淋巴细胞进行了scRNA-seq，发现晚期CTCL皮肤存在较大的肿瘤间和肿瘤内异质性，并证实了增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、ATP5C1、核仁纺锤体相关蛋白（nucleolar spindle-associated protein1,NUSPA1）和TOX 基因在CTCL 晚期患者的淋巴细胞中高表达，该研究确定了肿瘤特异性分子标志，对肿瘤的诊断和个性化治疗具有重要意义。Li 等［22］通过对1例皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤（subcutaneous panniculitis-like T cell lymphoma，SPTCL）患者的病变组织进行scRNA-seq 后定义了恶性细胞及免疫细胞亚群，该研究发现SPTCL 恶性细胞表达某些正常免疫细胞不存在的基因特征，包括趋化因子家族、细胞毒性蛋白、T细胞免疫检查点分子和免疫球蛋白家族，并通过与正常T细胞比较，进一步发现恶性细胞中特异性表达潜在的SPTCL新标志物，如细胞骨架RNA（cytoskeleton regulator RNA，CYTOR）、趋化因子CXC 配体-13（chemokine CXC ligand13，CXCL13）、血 管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和T 细胞免疫球蛋白黏蛋白域-4（T-cell immunoglobulin and mucin domain 4，TIDM4）。

3.2.2 B 细胞淋巴瘤 B 细胞淋巴瘤可出现在B 细胞正常发育的任何阶段，但大多数源于生发中心的细胞，主要包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）、套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、华氏巨球蛋白血症（Waldenström's macroglobulinemia，WM）等［18］。

DLBCL是NHL中最常见的组织学亚型，常呈侵袭性，占NHL 的30%~58%［23］。DLBCL 的发病机制较为复杂，主流观点认为是由生发中心或生发中心外B细胞恶性克隆的转化和扩增导致［24］。Park等［25］对6例难治性DLBCL和7例反应性DLBCL患者的淋巴瘤样本进行了scWES 和scRNA-seq，发现编码区中致病性体细胞单核苷酸变异和插入缺失在难治性患者与反应性患者中无明显差异；3例难治性患者中出现TP53 的错义突变，且TP53 的所有错义突变都伴随着拷贝数缺失；难治性患者中MYD88、B2M、SORCS3 和WDFY3 突变较反应性患者更常见。该表达谱揭示了与治疗抵抗相关的基因，有助于抗肿瘤药物的研发。

FL是NHL 中第2常见的类型，其发病是一个复杂、多阶段的过程，常呈惰性表现［26］。Andor等［27］利用scRNA-seq分析了6例原发FL患者淋巴结活检组织的34 188 个细胞的转录组，将其分为8 个造血谱系，分别包括B 细胞谱系、单核细胞谱系、自然杀伤细胞谱系、CD4+记忆细胞谱系、调节性T 细胞谱系、CD4+初始细胞谱系、CD8+记忆细胞谱系及CD8+初始细胞谱系。随后，Andor又根据基因表达水平确定了正常免疫亚群和恶性B 细胞亚群，通过比较来自同一患者的恶性B 淋巴细胞和正常B 细胞基因，发现恶性B 淋巴细胞免疫球蛋白轻链（Igκ 或Igλ）表达下调，B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2）基因表达上调，低亲和力免疫球蛋白E 受体2（low-affinity IgE receptor，FCER2）、CD52以及MHC-Ⅱ表达下调。该团队还发现多个恶性FL细胞亚克隆共存，并发现CD4+调节性T 细胞（Treg）中已知的免疫检查点基因与转录因子和免疫调节因子（包括CEBPA 和B2M）共表达，且该结果与流式细胞术的结果一致，进一步验证了scRNA-seq在看似均一的细胞中识别不同细胞亚群的能力。该研究有助于更好地了解肿瘤的免疫微环境，从而推动免疫治疗的发展［28］。

MCL是NHL的一种罕见亚型，异质性及复发率高［29］。Wang等［30］对1例耐多药的MCL患者约4 000个骨髓细胞进行了scRNA-seq，共鉴定了10 个亚群，其中包括4 个恶性B 细胞簇，3 个T 细胞簇，2 个树突状细胞簇和1 个NK 细胞簇。该研究揭示了MCL 中由Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型B 细胞介导的免疫逃逸机制：抗穿孔素活性、降低免疫原性、直接抑制凋亡和细胞杀伤。一方面，BCL2 家族成员（Ⅰ型B 细胞中的MCL1 和Ⅲ型B 细胞中的BCL2 L12）的过表达可以抑制穿孔素表达，减少癌细胞的损伤，高表达HSP90AA1 进一步促进了BCL2 L12 的表达；另一方面，MCL 恶性细胞中MHC-Ⅰ基因（包括HLA-A、HLA-B和HLA-C）的缺失导致MHC的缺失，从而避免了Ⅰ型、Ⅱ型T细胞的识别。此外，含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列蛋白5（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 5，BIRC5）、染色质解旋酶DNA 结合蛋白2（chromodomain helicase DNA-binding protein 2，CHD2）和PCNA在Ⅲ型B细胞中高表达。BIRC5和CHCHD2抑制细胞凋亡，而PCNA 抑制NK 细胞的杀伤作用，抑制细胞凋亡和细胞杀伤是恶性肿瘤的另一种潜在免疫逃逸机制，上述发现将对抗癌药物的研发起推动作用。

WM是一种罕见的B淋巴细胞增殖性疾病，表现为骨髓中的淋巴浆细胞性淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL）伴血液中IgM 型单克隆丙种球蛋白病，其细胞成分包括恶性淋巴细胞和浆细胞［31-32］。Treon 等［33］收集了30例WM 患者的骨髓LPL 细胞进行scWGS 发现,MYD88 L265P 复发突变在WM 患者中较常见，该突变存在于90%以上的WM 或非IgM型LPL患者的肿瘤标本中。MYD88 L265P的存在有助于将WM 和非IgM LPL 与其他具有相同特征的B细胞疾病（如边缘区淋巴瘤和多发性骨髓瘤）区分开来，并深入了解WM 的发病机制［34］。但MYD88 L265P信号通路能否应用于靶向治疗仍有待观察。

4 小结与展望

与传统的肿瘤整体分子表型分析相比，SCS 具有更大的优势，其可以对肿瘤患者的单个癌细胞进行分析，在研究肿瘤内异质性、化疗耐药性、肿瘤的演进等方面有较大的优势，具有实现癌症精准治疗的强大潜力［35］。尽管目前的SCS技术仍有一些问题尚未解决，如耗时长，费用高，存在尚无法避免的技术误差（如有效细胞的破坏或丢失、覆盖率低、测序结果偏倚、错误率高、通量有限），样本要求高等［14，36］。但随着新技术的发展，SCS 的检测时间将会缩短，费用将会降低，而测序的灵敏度和特异度也会不断提高。基于单细胞水平的分子表型分析有望应用于临床。