细胞外基质在女性盆腔器官脱垂手术中的应用进展

翁雨亭，蒋秀秀，方克伟

(1.昆明医科大学研究生院，昆明 650000； 2.昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，昆明 650000)

盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)是指一个或多个盆腔器官(膀胱、直肠、尿道、子宫等)进入阴道或通过阴道向下膨出[1]，通常由盆腔支撑系统无法提供持续的支撑力所致[2-3]。在重力(如长时间站立、运动后)或非重力作用下(如长时间仰卧)，POP症状会加重，且腹肌紧张时症状更明显[4]。POP在成年女性中十分普遍，流行病学显示，我国成年女性POP患病率约为14.80%，且绝经后患病率随着年龄增长而明显升高[5]。POP严重影响女性生活质量，给社会带来巨大经济负担[6]。

POP的传统对症治疗药物包括三环类抗抑郁药[7]、雌激素抑制剂[8]、α肾上腺能激动剂、中药[9]等，但目前尚无针对POP的特效药物，临床常以手术治疗作为最终治疗手段，约10%的有症状患者接受POP手术治疗，手术材料常选用单丝聚丙烯网片，但网片与骨盆组织的机械特性不匹配可能导致网片排异、侵蚀以及网片暴露等特定并发症[10]，这极可能是POP患者手术治疗后复发率较高的主要原因[11-12]。早在2011年，美国食品药品管理局发现经阴道放置网片治疗POP存在严重的安全性问题，并于2016年将其归类为“高风险”材料，并建议无症状POP患者仅进行常规护理即可[13]。鉴于此，寻找组织兼容性更好、安全性更高的盆底肌重建材料是降低POP术后并发症发生率的重要影响因素。现就细胞外基质(extracellular matrix，ECM)涂层聚丙烯网的特性、制备技术及其在女性盆底重建中的应用研究和技术改良予以综述。

1 ECM的特性及分类

ECM是常驻细胞的分泌产物，参与构成复杂的由结构和功能分子组成的独特的组织特异性三维细胞外微环境[14]。ECM可调节细胞的形状、极性、凋亡、增殖和侵袭，并使其在正常情况下发挥生物力学性能[15]，成为近年组织再生领域的新型材料。ECM可细分为间质ECM(主要由纤维状胶原、弹性蛋白和纤连蛋白组成)和专门的细胞黏附性ECM[16]。ECM亚类包括胶原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、ECM相关蛋白、ECM调节剂和分泌因子等，其中最重要的是胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ及弹性蛋白，它们是维持结缔组织强度及组织完整性的基础[17]。

影响ECM重塑反应的因素包括募集内源性干细胞和祖细胞、螯合生长因子[18]、降解过程中释放具有生物活性ECM片段[19]以及调控巨噬细胞表型来调节先天免疫反应[20]。研究表明，带有ECM的支架可形成丰富的血管反应，其中血管生成因子(血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β)有利于植入部位的细胞生长及组织愈合[21]。现代技术通过冻干、酶消化等过程将ECM制成室温下呈液体且37 ℃时呈胶冻样的温敏性水凝胶，其可黏附于人体局部组织并持续发挥作用[22]。目前，不同组织来源ECM水凝胶的组织重塑性均较强，其作为一种新型支架载体已广泛应用于组织工程领域。

2 ECM涂层聚丙烯网制备技术

2.1ECM涂层聚丙烯网技术原理 人工合成材料上往往没有细胞黏附位点，而聚丙烯网片可通过适当的化学方法(如应用一些亲水材料或通过改变几何形貌)提供足够的细胞黏附力，以利于细胞在这些生物惰性材料上黏附和生长。目前ECM与聚丙烯结合形成的最常见材料为ECM涂层聚丙烯网。ECM中包含的生物活性因子可作为化学引诱剂，通过招募细胞增强细胞反应和生物功能，使主要蛋白质(包括纽蛋白和肌动蛋白)表达增加，以实现快速骨再生和切口愈合[23]。

2.2实验室ECM涂层的聚丙烯网制备步骤 目前实验室常用的ECM涂层为猪真皮ECM，其传统实验室制备方法为：通过机械分层去除猪全层皮肤的皮下脂肪和表皮，依次用胰蛋白酶处理6 h、70%乙醇处理10 h、3%过氧化氢处理15 min后，将其在含有1% Triton X-100的0.26%乙二胺四乙酸溶液中放置6 h后更换新鲜溶液再放置16 h，随后在0.1%过氧乙酸4%乙醇浸泡2 h[24]。需要注意的是，每次更换溶液后都用纯水冲洗，最后交替使用纯水和磷酸盐缓冲液冲洗，且所有的化学变化均在300 r/min的轨道振动器搅拌下进行。然后，将真皮ECM冷冻、冻干，并粉碎成40目的粉末。将经酶解后的真皮ECM粉溶于胃蛋白酶溶液，48 h后配置成浓度为10 mg ECM/ml的溶液。将溶解后的真皮ECM置于冰上，加入一定体积的磷酸盐缓冲液与氢氧化钠，使其达到生理pH值和盐浓度，然后用磷酸盐缓冲液进一步稀释至8 mg ECM/ml，立即将ECM消化液加入预切的聚丙烯网片中，直至凝胶化发生。处理好的聚丙烯网置于37 ℃孵化器中30～45 min，直到真皮ECM在网状物周围和聚丙烯网纤维之间形成水凝胶，随后将真皮ECM水凝胶包埋网片置于37 ℃环境风干12 h，完成包覆过程。

3 ECM涂层聚丙烯网在女性POP手术中的优势及应用研究

术后异物反应常与纤维化、组织顺应性下降有关，而局部炎症与聚丙烯不可降解有关，而天然ECM合成的网状材料可降低纤维化程度，但存在机械强度较低、提供的支撑力有限、在体内降解速率不一等问题[25]。可见，ECM涂层聚丙烯网既不影响网片的机械强度又可减轻术后异物反应。

3.1减少局部炎症反应 ECM可通过限制破坏性炎症反应、招募所需细胞群(包括祖细胞)以及支持细胞附着、增殖和基质生产来促进特定位点的功能性组织重塑[26]。哺乳动物的ECM中存在抗菌肽，与合成支架材料相比，猪小肠ECM涂层支架的持续性细菌感染抵抗力更强，但其作用机制尚不清楚[27]。

Wolf等[24]将传统聚丙烯网片与猪真皮ECM涂层聚丙烯网分别置于雌性大鼠腹部，分别在不同时间点处死大鼠后进行组织学和力学分析，结果显示，ECM涂层聚丙烯网可有效减轻典型的异物反应及炎症反应，且在不降低机械强度的情况下，ECM涂层聚丙烯网片的网状结构孔径更大，即通过减少每单位面积纤维累积和纤维组织的沉积增加ECM涂层聚丙烯网片的柔顺度，从而预防萎缩。在植入网片后期，已降解涂层被疏松的胶原结缔组织代替，减少了初始细胞向网孔区域的浸润，即ECM涂层有利于网片植入后短期内的组织重塑。

为探究ECM涂层聚丙烯网片植入部位炎症反应减轻的原理，有研究采用荧光标记法测量巨噬细胞表型并进行组织学分析发现，ECM涂层能减弱M1型巨噬细胞的反应，并增加M2/M1与聚丙烯网的比值[28]。Faulk等[29]的动物实验显示，在6个月内，ECM涂层不影响网眼内的组织强度，且植入网片部位成熟胶原沉积减少，慢性炎症反应减轻。Sicari等[30]发现，与年长动物衍生的支架相比，年幼动物衍生的支架更具建设性，更适合部位的组织重塑反应，这为ECM涂层的优化提供了新思路。

3.2促进骨盆及阴道内新生胶原的成熟 盆底新生胶原成熟是影响POP术后恢复的因素之一。在分子间疏水和静电力的作用下，胶原蛋白分子易在固定溶液环境中自组装成原纤维[31]。Darzi等[32]在骨盆解剖和阴道大小与人类相似的羊模型中，比较未修饰的PP网和两种含胶原网片的长期组织反应，通过免疫染色和形态计量学定量观察巨噬细胞表型、对植入网状物的反应以及血管数量，利用Sirius Red双折射和形态计量学定量分析显示，ECM成分、胶原组织和网状植入物界面周围面积百分比的变化在网状组织界面的微观分子水平上存在显著差异；与阴道内植入的未经修饰的聚丙烯网相比，网眼中的胶原蛋白可明显促进网眼丝周围胶原纤维的成熟，使涂覆胶原蛋白网片中的总成熟胶原蛋白和未成熟胶原蛋白水平均更接近天然组织。Wang等[33]将制造的仿生胶原蛋白支架应用于大鼠跟腱缺损模型，观察到纳米水平上随胶原纤维形成而出现平行排列的胶原蛋白原纤维，同时再生肌腱的横截面也出现胶原蛋白基质沉积和重塑，提示胶原蛋白覆膜网片通过促进新胶原成熟改善生物相容性和愈合反应。

3.3维持阴道平滑肌形态与功能 ECM涂层聚丙烯网可有效维持阴道平滑肌的功能及形态，有利于术后盆底功能的恢复。Nagatomi等[34]发现，神经支配对于维持正常的平滑肌形态和功能至关重要。Shaffer等[35]在恒河猴模型中比较了传统聚丙烯网片、双层ECM复合网片及单纯6层ECM生物支架肌束和肌细胞形态、横截面直径和α平滑肌肌动蛋白的表达，并采用神经介导的平滑肌收缩性测试研究神经密度，结果显示，单独植入聚丙烯网片可导致局部肌肉形态紊乱，并可使阴道平滑肌收缩力降低63%、阴道神经密度降低48%、阴道α平滑肌肌动蛋白表达降低68%；与聚丙烯网片植入相比，双层ECM复合网片及单纯6层ECM生物支架植入后阴道平滑肌的肌束更有条理，组织形态类似于假手术，且阴道α平滑肌肌动蛋白水平升高近2倍，几乎与假手术无差别。但单纯6层ECM生物支架植入会导致阴道平滑肌出现诱导适应性反应，即增加小的平滑肌束数量，而肌细胞大小或收缩功能并未改变。这为探索植入的ECM复合网片在微观形态、收缩特性、神经支配方面对阴道平滑肌结构和功能的影响机制提供了重要证据，为ECM复合网片在POP手术中的应用带来希望。

4 ECM涂层聚丙烯网在女性盆底手术领域的技术改良

4.1组织原位脱细胞法(in situ decellularization of tissue，ISDoT) 脱细胞技术可将ECM从天然细胞和遗传物质中分离出来，同时保留ECM的固有结构、生物学活性及机械完整性[36]。经脱细胞技术处理的ECM可形成天然支架，防止盆底组织塌陷，且其还可进行再细胞化，以产生功能性组织或器官。

传统的脱细胞技术无法提高ECM体系结构的体内成像分辨率，且可能影响组织的完整性和生物分子结构。鉴于此，Mayorca-Guiliani等[37]开发了一种以血管流为导向的脱细胞方法，称为ISDoT，该方法可通过小鼠的心血管系统将脱细胞试剂有效地递送至任何器官或组织，其原理是利用天然组织和器官脉管系统有效去除细胞，防止组织塌陷，以维持组织ECM结构的稳定；研究者通过二次谐波成像和染色观察到，ISDoT可实现任何组织或解剖器官系统的完全脱细胞化并保留ECM结构，这为研究天然ECM成分的组成和分布以及绘制健康和患病器官的三维(3D)空间结构图提供了可能。质谱分析结果表明，ISDoT可用于分析ECM的所有亚类，提示ISDoT可用于多种组织和器官，但不会丢失ECM成分；进一步修改原始程序后，ISDoT可对包含盆底组织的33种不同组织进行脱细胞处理[38]。因此，ISDoT在组织发育和体内平衡以及疾病发展过程中发生的ECM重塑结构的研究中具有巨大潜力，并具有3D成像功能，有利于术后ECM网片的体内定位，避免破坏ECM结构。目前，ISDoT已在小鼠模型中应用，随着手术领域的扩展，未来ISDoT在女性POP手术中的运用有巨大潜力。

4.2具有可控3D结构的纳米电纺纤维ECM 电纺丝利用静电力从聚合物溶液或熔体中形成直径通常为1～10 μm的聚合物纳米纤维或微纤维垫，其结构与天然的ECM相似，导致基质具有较高的表面积与体积比，在体内植入时可促进细胞黏附与生长[39]。此外，电纺纤维可由多种生物或合成聚合物制成，其具体类型取决于特定的应用和患者的病情[40]。纳米纤维生产的静电纺丝新技术源于工业，用于生产可降解聚合物，目前生物领域有一种具有大规模生产纳米纤维ECM的新型工业无针多喷静电纺丝设备，该纳米纤维ECM具有可控的3D形态。研究表明，在不同加工条件(如电压、电极距离、旋转电极速度级电场强度)下，不同浓度明胶聚合物溶液经电纺丝化后均可获得具有较理想3D形态的3D结构纳米电纺纤维；与传统平面聚合物材料相比，具有3D结构的纳米电纺纤维的生物相容性更强，且其表面附着的间充质干细胞增殖明显改善；蛋白质印迹分析结果显示，间充质干细胞中α-微管蛋白和桩蛋白的表达增加[24]。未来，无针多喷静电纺丝技术可能用于批量生产具有固有生物相容性和干细胞理想整合能力的人工ECM，且其可能在临床手术中大规模应用。

4.3添加雌二醇的ECM涂层聚丙烯网 阴道壁中足够的ECM有助于维持盆底结构，而雌激素通过控制胶原的重塑速度在维持盆底结构中起关键作用；另外，雌二醇还具有直接刺激血管内皮细胞以及上调血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体表达的促血管生成作用[41]。临床中，晚期POP患者阴道成纤维细胞的重塑能力大大降低。Weber等[42]发现，术前局部使用雌激素能够有效改善POP患者盆底结构的完整性。Rahn等[43]研究显示，低浓度雌激素可通过刺激阴道成纤维细胞的分裂以及改善阴道周围血管的血供来改善盆底结构。有研究者在电纺丝技术的基础上，将脂溶性17-β-雌二醇添加于PU聚合物溶液中，在人脂肪来源的间充质干细胞接种的聚合物支架上进行为期3个月的雌二醇释放检测实验，结果显示，从实验第10天开始，支架连续3个月释放有效的低浓度雌二醇，提示添加雌二醇的ECM支架可促进体外细胞模型阴道成纤维细胞的再生、加速盆底血供恢复[2]，但相关体内及临床试验尚未开展。

5 目前ECM涂层聚丙烯网用于POP手术的缺点

网状聚合物的类型、材料重量、细丝结构和孔径是体内生物相容性的重要决定因素[40]。ECM涂层聚丙烯网在体内的生物相容性明显提高。由于ECM涂层聚丙烯网无法达到ECM在天然生物组织中的应变值，修补后的组织不能完全达到损伤前的自然状态。同时，由于有关ECM涂层聚丙烯网的长期研究较少，其长期有效性及降解后的影响等尚无法评估[24]。目前暂无统一且高效的ECM合成与制备方法，现有制备方法存在难度大、费用高等问题，极大地限制了ECM涂层聚丙烯网的研究和应用[44]，且ECM涂层聚丙烯网的应用大多限于动物模型，其用于女性盆底重建还需要大量安全性研究的证实，故尚未完成临床应用转化。严谨的动物实验研究和临床试验是ECM涂层生物材料成熟应用于临床的关键。因此，加速生物材料的发展有助于未来ECM的临床应用。

6 小 结

女性盆底疾病严重影响中老年女性生活质量，手术治疗是重度POP的终末治疗手段。传统的单丝聚丙烯网片广泛存在排异反应，这是引起POP手术复发率较高的原因，因此需要寻找一种可以减少炎症及排异反应，且机械硬度不降低、能够维持正常盆底器官结构及位置的材料。与传统材料不同，ECM涂层生物材料在保留传统材料机械硬度的同时具备一定的生物相容性，可抑制炎症反应、减少巨噬细胞、促进新生胶原成熟，有助于维持平滑肌的形态与功能。国内动物实验表明，ECM涂层聚丙烯网可改善POP术后炎症、排异反应及其并发症[45]，但各种来源ECM各具优缺点，故ECM涂层聚丙烯网在临床盆底手术中的推广应用仍需大量临床病例对照研究以及长时间随访的进一步验证。未来，可通过各类技术改良使ECM涂层聚丙烯网具有更好的生物学效应，并可通过完善ECM涂层生物材料的功能，提升其体内植入的精确度。