CpG-ODN 作为免疫耐受诱导剂的研究进展

李晓奇，栗 林，贾淑萍，王凤武

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

免疫系统的主要作用是保护宿主免受细菌、病毒、真菌或寄生虫等外部病原体的侵害。 免疫细胞能将病原体与自身抗原和无害的外部抗原区分开来，从而诱导对病原体的保护性免疫以及对自身抗原和无害的非自身抗原的耐受性［1］。 免疫耐受失调可能导致免疫介导性疾病，如自身免疫疾病、癌症和各种速发型过敏性疾病［2］。过敏性疾病的特点是临床表型和症状多种多样，包括呼吸道疾病，如过敏性鼻炎和哮喘［3］。常见的全身性过敏反应包括对食物和昆虫毒液过敏［4］以及皮肤湿疹/特应性皮炎［5］。 虽然一些过敏性疾病的临床表现是轻微的，可以通过对症药物控制，但相当多的患者有危及生命的发作风险［6］。例如，过敏性哮喘可能会变成慢性呼吸道疾病并严重影响患者终生的呼吸功能。 尽管过敏表现和症状存在差异， 但过敏性疾病的分子和细胞机制是相似的，其特征是2 型辅助性T 细胞（T-helper lymphocyte type 2，Th2） 反应和浆细胞产生过敏原特异性免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）［7］。 过敏已成为一个主要的健康问题。 近几年，IgE 介导的过敏性疾病发病率在发达国家和发展中国家都在增加。

1 过敏原特异性免疫疗法（allergen-specific immunotherapy，ASIT）的机制

ASIT 建立免疫耐受意味着免疫反应的改变，例如通过诱导调节性T 细胞 （regulatory T cells，Tregs）和调节性B 细 胞（regulatory B cells，Bregs）加强免疫记忆。在人和小鼠中观察到Tregs 的诱导及其在疾病消退中的重要作用。 Tregs 通过多种协同机制发挥免疫调节作用， 如分泌IL-10、IL-35和TGF-b［8］，以及通过一些细胞表面受体，如细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4 （cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）、淋巴细胞活化基因3 （lymphocyte-activation gene-3，LAG-3）、程序性细胞死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）及T 细胞免疫球蛋白和ITIM 域 （T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）［9］发挥作用。在某些情况下，Tregs 单独作用可能不足以减少过敏性炎症。 Tregs 已被证明与Bregs 协同作用以促进免疫耐受。 Bregs 构成一种特定的B 细胞亚型，可产生抗炎细胞因子IL-10 和/或IL-35［10］。 已发现Bregs 在接受ASIT 治疗的患者体内合成过敏原特异性IgG4［11］。 阻止特异性IgE 与过敏原结合的阻断抗体对于调节无临床症状的过敏性疾病也至关重要。 注射单剂量的2 种单克隆IgG4 抗体，通过被动免疫疗法阻断猫的主要过敏原Feld1，成功缓解了患病猫的急性过敏症状［12］。 小鼠中不存在IgG4，但IgG1、IgG2a 和IgG3 与小鼠ASIT 模型中的保护作用有关。 在ASIT 情况下，IgA 也被证明通过中和黏膜表面的过敏原发挥保护作用。 先天免疫系统主要参与ASIT 的早期。 树突状细胞（dentritic cells，DCs） 尤其是浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）已被证明是ASIT 期间耐受诱导的主要细胞介质， 可导致Tregs的产生。 DCs 利用多种因子促进Tregs 的分化，包括可溶性因子，如IL-10、TGF-b 或吲哚胺2，3-双加氧酶 （indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）［1］，以及细胞配体，如诱导型共刺激配体（inducible costimulator-ligand，ICOS-L） 或程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）和PD-L2［13］。

2 CpG-寡脱氧核苷酸 （CpG-oligodeoxynucleotide，CpG-ODN）及其种类

为区分病原体结构和自身抗原， 免疫系统具备能够识别危险的特定系统信号或病原体相关分子 模 式 （pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。 PAMPs 包含多种病原体结构，例如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、鞭毛蛋白、聚糖结构、遗传物质（DNA 和RNA）等。免疫细胞可以通过模式识别受体 （pattern recognition receptor，PRR）特异性识别PAMPs。 与脊椎动物DNA 不同，细菌遗传物质富含未甲基化胞嘧啶—鸟嘌呤二核苷酸（CpG）， 这些未甲基化的细菌CG 基序的PAMPs被Toll 样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9）识别。含有未甲基化CpG 的短合成寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN） 序列模拟细菌DNA特征，用于激动TLR9，避免细菌污染物引起的任何其他TLRs 共激活。

到目前为止， 至少已鉴定4 种CpG-ODN，它们对免疫系统产生不同的影响，因此，了解其免疫调节特性至关重要。 A 类CpG-ODN 具有磷酸二酯/硫代磷酸酯骨架，包含1 个间接回文序列的单个CpG 基序，以及位于3′末端的多聚G 串。 B 类CpG-ODN 在硫代磷酸酯骨架内包含多个CG 双峰，后者能抵抗核酸酶消化，与A 类CpG-ODN 的磷酸二酯骨架相比，寿命延长了6 倍。 C 类CpGODN 是最近被报道的一种新CpG-ODN，是上述2种CpG-ODN 类型的组合。 与B 类CpG-ODN 一样，C 类CpG-ODN 完全建立在硫代磷酸酯核苷酸上， 但它的回文CpG 基序与A 类相似［14］。 P 类CpG-ODN 是最近研发的，与其他CpG-ODN 类型不同， 它包含2 个有助于形成更高阶结构的回文序列。

3 TLR9 下游信号及其对CpG-ODN 浓度的依赖

TLR9 与CpG-ODN 的结合点位于细胞胞内体， 需要CpG-ODN 的内化和胞内体的摄取刺激TLR9 并触发其信号级联。TLR9 一旦被CpG-ODN结合激活， 它的胞质结构域， 即Toll/IL-1 受体（Toll/IL-1 receptor，TIR） 结构域就会受到刺激并进一步传递信号。 TIR 结构域与TLR 衔接蛋白髓样分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）相互作用是经典的结合模式。随后，IL-1R相关激酶1（interleukin 1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）、IL-1R 相关激酶2 （IRAK2）、IL-1R 相关激酶4（IRAK4）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）被磷酸化［1］，并依次募集几种丝裂原活化蛋 白 激 酶 （mitogen -activated protein kinases，MAPKs）和其他激酶，例如IκB 激酶（IκB kinase，IKK）。 这些激酶促进了各种转录因子向细胞核的易位，例如激活B 细胞核因子kappa-轻链增强子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1） 或干扰素调节因子7（interferon regulator factor 7，IRF7）［15］。 这些转录因子激活促炎基因的转录，如TNF、IL-1B、IL-1A 基因和1 型IFN 基 因 （IFNA 和IFNB）。 pDCs 响 应TLR9 激活产生1 型IFN 已被证明依赖于MyD88-IRF7 信号耦联。 CpG-ODN 诱导的基因表达特征动力学是复杂的。 研究表明， 在体内注射CpG-ODN 后仅30 min，一组基因就被上调，在给药后约3 h 达到表达峰值； 在给药后第5 天观察到第2 个延迟峰值， 证明CpG-ODN 可以产生短期、中期和长期影响。 进一步研究表明，包含TIR结构域的接头诱导IFN-b （TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-b，TRIF） 被 证 明 在TLR3 和TLR4 激活时发出信号［16］。

最近的研究证明， 除了经典的MyD88 通路，TLR9 还可以通过TRIF 发出信号， 当高浓度的CpG-ODN 作用于pDCs 时，TLR9 会通过TRIF 发出信号， 而使用较低浓度的CpG-ODN 时，TLR9会接合经典的MyD88 接头。 TLR9 下游信号传导的差异暗示了差异基因表达特征。 一方面，MyD88转导通路同时触发了经典NF-κB 和非经典NFκB 通路， 导致促炎细胞因子的表达， 如TNF-a、IL-1b、IL-12、IL-6 和IL-23。另一方面，TRIF 下游信号仅激活非经典NF-κB 通路和IRF3，导致抗炎介质如TGF-b 和IDO 的表达。 这项研究提出了一个新的观点， 即TLR9 可以根据配体浓度被不同程度激活。 TLRs 在人外周血单个核细胞上的分布是可变的。 虽然TLR9 在一些人类免疫细胞如中性粒细胞和单核细胞中不表达，但它在pDCs 和B细胞中高表达， 在NK 细胞和T 细胞中的表达水平较低。 在小鼠中，TLR9 表现出与人类相似的表达和激活模式，仅有细微的差别。 例如，由于缺乏TLR9 表达， 来自人外周血的单核细胞不会被CpG-ODN 激活。 然而， 小鼠单核细胞表达TLR9并通过参与NF-κB 通路和随后产生细胞因子（如TNF-a）响应CpG-ODN 刺激。 在与过敏性气道疾病相关的器官中， 人和小鼠肺泡巨噬细胞表达TLR9。 然而， 只有人而不是小鼠的肺DCs 显示TLR9 表达。

目前的研究发现，CpG-ODN 可能会诱导一些在小鼠和人类之间略有不同的免疫反应［17］。此外，激动TLR9 的最佳CpG-ODN 序列因物种而异。然而，TLR9 激活产生的影响在物种之间基本保持不变，因为上游、下游转导元件是非常保守的。 尽管如此， 在动物模型中应用基于CpG-ODN 的治疗时应考虑种间差异。

4 CpG-ODN 对免疫细胞的影响

CpG-ODN 影响许多类型的免疫细胞，尤其是抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APCs），如DCs 和巨噬细胞。 DCs 前体表达各种TLRs， 包括TLR9， 从而使它们能够被CpG-ODN 激活。 由于pDCs 表达高水平的TLR9， 已经成为研究CpGODN 的模式细胞。CpG-ODN 促进pDCs 向淋巴结的迁移并刺激其产生细胞因子， 例如IL-6、TNFa、IFN-1 和粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）。 此外，CpG-ODN 诱导pDCs 表达几种共刺激表面分子，如CD40、CD54、CD80、CD86［18］。未甲基化的CG 基序也被证明可以促进pDCs 的抗炎表型。 经CpG-ODN 处理的pDCs 可以诱导CD8+Tregs 表达免疫抑制分子， 如LAG3 和CTLA4。 类似， 用CpG-ODN 刺激的pDCs 可以启动未成熟T 细胞分化为CD4+CD25+Treg，产生IL-10和TGF-b。 朗格汉斯细胞表达TLR9 并在小鼠皮内注射CpG-ODN 后迁移。 脾DCs 亚群能够在体内注射CpG-ODN 后产生有效的IDO 信号， 从而获得类似Tregs 的免疫抑制能力。 用C 类CpGODN 刺激的pDCs 可以直接使人B 细胞以不依赖T 细胞的方式分化为浆细胞并产生抗体。B 细胞也受CpG-ODN 的影响。 CpG-ODN 是一种强有力的B 细胞有丝分裂原，诱导它们产生IL-6 和IgM，并在Ig 产生过程中促进它们的激活和分化。 同样，用CpG-ODN 刺激B 细胞会改变后者的Ig 谱并产生不同抗体， 这种效果依赖TRL9 和MyD88 信号传导。 NK 细胞可以通过直接或间接信号在CpGODN 刺激下发生反应。 研究表明，NK 细胞不能直接响应CpG-ODN，而是通过被CpG-ODN 激活的pDCs 产生的可溶性因子间接触发。 其他研究同样支持以下观点，即CpG-ODN 可以直接诱导NK 细胞产生IFN-g 并提高其活性。 由于T 细胞表达的TLR9 水平非常低，推断CpG-ODN 不会直接刺激T 细胞。 与NK 细胞类似，T 细胞是通过被CpGODN 激活的pDCs 传输的信号参与反应。 尽管CpG-ODN 对T 细胞没有直接影响，但有一些研究指出，CpG-ODN 可以在没有任何中间体的情况下刺激T 细胞，但以独立于TLR9 和MyD88 的方式。有研究表明，纯化的人T 细胞和NK 细胞在CpGODN 的直接刺激下产生IFN-g。 此外， 有研究表明，MyD88 对于CD4+T 细胞直接接受CpG-ODN刺激是必不可少的。

总之， 每种CpG-ODN 对各种免疫细胞都有广泛的影响。 在将CpG-ODN 作为ASIT 佐剂的研究中，B 类CpG-ODN 因其在pDCs 中诱导免疫耐受性表型的突出能力而备受关注。

5 CpG-ODN 作为ASIT 免疫耐受诱导剂的作用机制

5.1 CpG-ODN 通过DCs 诱导过敏原特异性免疫调节

DCs，尤其是pDCs，在CpG-ODN 刺激下产生IL-10、TGF-b 和IDO， 这使得它们成为非常有效的Tregs 诱导剂。先天免疫对于诱导适应性免疫系统的耐受反应至关重要，因此，调节APCs（如pDCs）和早期激活的适应性免疫细胞（如B 细胞）是改善ASIT 疗效的手段。研究表明，CpG-ODN 对免疫系统具有双重影响， 低浓度CpG-ODN 诱导炎症，高浓度CpG-ODN 诱导免疫调节和耐受，即相同的TLR 配体可以根据其浓度/剂量对免疫系统产生两种影响。 当CpG-ODN 被用作疫苗接种的佐剂时，很低剂量就能引起细胞毒性或炎症反应。当CpG-ODN 在动物模型中被证明可以成功诱导免疫耐受和治疗过敏时，使用的剂量很高。有学者研究表明，pDCs 是关键的免疫细胞，原因是pDCs在免疫系统中的经典作用是通过病毒遗传物质激活TLR 危险信号而产生1 型IFN 促进对病毒侵袭的防御。 pDCs 已被证明通过几种可溶性因子和膜信号蛋白促进免疫耐受。 几项研究表明， 通过CpG-ODN 刺激pDCs 会导致免疫耐受性的诱导，这可能是由成熟的病毒感染触发的1 型IFN 反应与通过高剂量CpG-ODN 单独激活TLR9 导致的。为了区分来自不同刺激源的pDCs 衍生的1 型IFN 效应，进一步研究结果显示，人pDCs 的NLRP1 和NLRP3 表达量极低，表明它们激活炎症小体的能力较弱［19］，因此，它们几乎不能诱发炎症反应，而是被编辑为诱发免疫耐受。 CD5+CD81+pDCs亚群在CpG-ODN 刺激下不产生1 型IFN，但会诱导强烈的Tregs 分化。 经典树突状细胞（conventional DCs，cDCs）也已被证明可以通过人和小鼠的Tregs 诱导促进免疫耐受。 2 型经典树突状细胞（cDCs2a）显示出更高的TLR9 表达水平，并可在CpG-ODN 刺 激 下 诱 导Tregs 分 化。 DCs 已 被 用于通过免疫耐受诱导将免疫疾病逆转为免疫稳态［20-21］。 与过敏类似， 炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）缺乏适当的免疫调节。 研究表明，CpG-ODN 通过诱导DCs 免疫耐受改善IBD症状。研究显示，ASIT 使用猫过敏原Feld1 和高剂量的CpG-ODN 可以不同程度减少过敏性哮喘小鼠模型中的症状。

5.2 CpG-ODN 诱导Tregs 和Bregs

CpG-ODN 能够减少由氢氧化铝触发的Th2反应，这种作用取决于MyD88 和IL-10 的活性［22］。CpG-ODN 能够诱导免疫调节反应。早在1997 年，含有未甲基化CG 基序的细菌DNA 就被证明可以在黏附的小鼠脾细胞中诱导IL10 的产生。CpGODN 也被证明可以促进其他调节性细胞因子（如TGF-b）的产生。 TGF-b 对免疫调节至关重要，是诱导Tregs 分化的3 个关键信号之一。 此外，TGFb 在炎症后组织修复中发挥作用［23］。 几个小组已经研究了CpG-ODN 的不同给药途径在过敏性呼吸道疾病中的治疗机理。在第一项研究中，研究人员用CpG-ODN ［中高剂量：0.15 mg/（kg·BW）］在小鼠模型中预防蟑螂诱发的过敏性哮喘， 研究发现，肺裂解物中IL-10 的水平增加，这归因于CD4+FoxP3+Tregs 群体的增加。 在第二项研究中，研究人员发现通过鼻腔吸入（nasal inhalation，NI）途径给予CpG-ODN［高剂量：2.5 mg/（kg·BW）］，可通过分泌IL-10 显著缓解过敏性气道炎症。 在这种情况下，Tregs 不是IL-10 的来源， 但抗炎细胞因子是由CpG-ODN NI 治疗后募集的调节性巨噬细胞分泌的。这两个结果并不排斥，可以通过调节性巨噬细胞最初产生IL-10 解释，然后是Tregs 的连续分化和IL-10 的产生。 此外，在完成基于CpGODN 的ASIT 后， 在CpG-ODN/ASIT 处理的小鼠脾脏中发现了差异调节和从头表达的Tregs，包括已知特异性抑制Th2 反应的Tregs 亚型［24］。 除了Tregs，Bregs 对ASIT 的效果也至关重要。与其他免疫细胞相比，B 细胞表达更高水平的TLR9，因此，它们对CpG-ODN 更敏感。 研究发现，过敏反应的减少取决于产生IL-10 的滤泡B 细胞 （B220+CD19+CD23+IgM+CD40+MHCⅡ），表明被CpG-ODN刺激的B 细胞在过敏情况下具有促进免疫耐受的作用。CpG-ODN 诱导的产生IL-10 的B 细胞具有明显的肿瘤坏死因子受体2 （tumor necrosis factor receptor type 2，TNFR2）表达，这可以在基于CpGODN 的小鼠ASIT 模型中得到证实，B 细胞在注射部位表达更高水平的TNFR2。

5.3 CpG-ODN 诱导保护性免疫球蛋白产生并改善上皮细胞完整性

ASIT 减轻过敏症状的重要机制之一是B 细胞产生保护性免疫球蛋白，如IgG 和IgA。用CpGODN 刺激B 细胞会诱导小鼠产生免疫球蛋白，如IgG2a、IgG2b、IgG3 和IgA。 此外，CpG-ODN 可抑制体内IgE 的产生。CpG-ODN 还被证明可以通过非免疫细胞的共激活加强对过敏性疾病的保护。例如，CpG-ODN 可改善气道上皮细胞的紧密连接（tight junction，TJ），这种细胞在维持肺的稳态和预防过敏原引起的气道过敏方面起着至关重要的作用［25-27］。

5.4 CpG-ODN 诱导Th1 反应

CpG-ODN 已被用作ASIT 中的佐剂， 靶向先天免疫系统，提升ASIT 的治疗效果。CpG-ODN 已被证明可以诱导Th1 免疫反应。在体外使用CpGODN 可以促进IFN-g 和IL-12 的产生， 二者是在Th1 环境中产生的典型细胞因子。 在体内预防性过敏治疗中，CpG-ODN 能够诱导不可变的IFN-g依赖性Th1 反应，阻止随后Th2 过敏反应的建立。相比之下，将氢氧化铝作为佐剂，用于治疗小鼠乙型肝炎主要表面抗原（HBsAg）致敏时，会诱导Th2反应， 但用CpG-ODN 和HBsAg 处理时，CpGODN 能够诱导Th1 反应，覆盖预先建立的Th2 反应，因此，有学者曾提出诱导Th1 反应是治疗过敏性疾病的一种可能的细胞免疫机制。