淫羊藿苷治疗骨质疏松的相关通路研究进展

张浩，郑玉玲，丁辉

（天津中医药大学中一制药有限公司，天津 301617）

骨质疏松在中国有着较高的发病率，特别是50岁以上的中老年人，且女性的发病率远远高于男性，这是因为女性在绝经之后雌激素缺乏而导致的，骨质疏松已经成为威胁中老年人生活质量的常见病和多发病。目前治疗骨质疏松的药物主要分为两类：抗吸收药物和合成代谢剂，抗吸收药物有双磷酸盐（股骨骨折和颌骨坏死）、狄诺塞麦（皮肤湿疹和蜂窝组织炎）、选择性雌激素受体调节剂（血栓栓塞和中风）、降钙素（背痛和头痛），新出现的有组织蛋白酶K抑制剂、拉索昔芬等；合成代谢剂包括甲状旁腺素（骨肉瘤等）、雷尼酸锶（心脏问题），新出现的有抗硬化素抗体、多奈哌齐以及抑制骨髓脂肪生成的疗法等。中医学认为肾主骨生髓，肾对骨的生长、发育、平衡起着非常重要的作用，淫羊藿作为补肾药，药用历史悠久，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，主要用于阳痿遗精、肾阳虚衰、风湿痹痛、筋骨萎软、麻木拘挛等证[1]。淫羊藿苷是其中主要活性单体，现代医学实验表明：淫羊藿苷对骨组织、生殖系统、心血管系统、免疫系统、肿瘤、炎症等均有作用[2]。主要有3种细胞参与骨的生长与重建，包括软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞，其中成骨细胞可以促进骨形成，破骨细胞可以促进骨吸收，当骨吸收大于骨形成时，就会造成骨量减少，进而导致骨质疏松，淫羊藿苷可以通过多种信号通路活化成骨细胞、抑制破骨细胞，来对骨质疏松产生治疗作用，本文主要对淫羊藿苷抗骨质疏松作用的信号通路作出综述，以期为淫羊藿苷的进一步开发提供思路。

1 Wnt/β-catenin 通路

Wnt通路是由配体糖蛋白Wnt与LRP5/6和卷曲蛋白（FZD）组成的受体复合物的结合而激发的一种信号传导途径[3]，包括经典的Wnt/β-catenin通路和两条非经典通路，Wnt/Ca2+-dependent通路和Wnt/planar cell polarity（PCP）通路。Wnt通路与乳腺癌[4]、胃癌[5]、卵巢癌[6]、阿尔兹海默症[7]等疾病关系密切，其中经典的Wnt/β-catenin通路对骨质积聚、骨重塑和骨折修复至关重要[8]。Wnt/β-catenin通路在BMSCS的成脂成骨分化过程中发挥重要的作用，如李智奎等[9]使用不同浓度的淫羊藿苷体外培养骨质疏松大鼠BMSCS，探讨淫羊藿苷对BMSCS成骨与成脂双向分化的作用与机制，通过实验证明淫羊藿苷通过Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠BMSCS成骨分化，抑制其成脂分化作用；淫羊藿苷也可以上调Wnt通路的上下游基因来调节骨平衡，如Wang等[10]发现淫羊藿苷能够上调Runx2、cyclinD1和ALP的mRNA表达水平，通过Wnt/β-catenin通路促进成骨细胞增殖，其他通路可能参与了这一过程，但是淫羊藿苷的作用浓度还有待进一步研究；Huang等[11]对比了有无淫羊藿苷培养的间充质干细胞，并对其进行了RT-PCR和Western blot检测，结果表明淫羊藿苷能够上调成骨基因Runx2、OCN、OSX的表达，并且可以通过上调P-GSK来抑制βcatenin的降解。

2 OPG/RANK/RANKL通路

RANK（NF-kB 受体活化因子，TNFRSF11A）是位于破骨细胞上的RANKL（NF-kB受体活化因子配体，TNFSF11）的受体，RANKL与RANK结合后会激活破骨细胞，使其增殖分化，而OPG（骨保护素，TNFRSF11B）可以特异性的与RANKL竞争RANK，抑制破骨细胞的增殖，最近研究发现，OPG/RANK/RANKL通路对牙齿萌发[12]、神经系统等有作用[13]，运动训练可以通过增加OPG，降低RANKL来促进骨骼健康[14]，OPG/RANK/RANKL还与血管系统、免疫系统和骨关节有关[15-16]。

淫羊藿苷可以增加OPG/RANKL的比例，如吴祖峰等[17]探究不同剂量淫羊藿苷对骨质疏松大鼠OPG、RANK、RANKL表达的影响，发现治疗组OPG mRNA表达增加，RANKL mRNA、RANK mRNA表达下降，结果表明不同剂量淫羊藿苷可使骨质疏松症模型大鼠胫骨干骺端组织中OPG mRNA的表达升高，RANKL mRNA，RANK mRNA的表达降低，从而达到治疗骨质疏松症的目的；Qi等[18]通过给大鼠注射链脲佐菌素来构建糖尿病型骨质疏松，发现100 mg/kg的淫羊藿苷可以降低血糖、增加骨密度、降低血清骨转换标记物水平、增加Runx2、OPG/RANKL比例，这些结果表明淫羊藿苷通过上调Runx2和OPG/RANKL的比例来治疗糖尿病型骨质疏松症；Wang等[19]发现淫羊藿苷与力负荷刺激耦合作用去卵巢小鼠，发现与淫羊藿苷或力负荷刺激单独使用相比，可以显著提高OPG/RANKL的比例，这表明力负荷刺激联合淫羊藿苷可能比单独使用力负荷刺激治疗骨质疏松具有治疗优势。OPG/RANK/RANKL通路主要调节破骨细胞的增殖与活化，对破骨细胞的存活有重要意义。

3 MAPK通路

MAPK作为细胞内重要的信号传递者，从酵母菌到人类，所有真核生物都能在体内表达MAPK，它调解着细胞增殖、分化到凋亡的多个过程，它可以磷酸化很多的蛋白质，并极大地影响基因表达、代谢、细胞分裂等过程。MAPK包括三层激酶级联反应-MAPK3K、MAPK2K、MAPK，在哺乳动物中，MAPK主要有三个家族，分别是ERKS、JNKS、P38/SARKS，已经确定的 MAPKS 家族有：ERK1、ERK2、ERK3/ERK4、ERK5；JNK1、JNK2、JNK3；P38α、P38β、P38γ、P38δ[20-21]。研究发现，淫羊藿苷可以通过抑制p38、JNK、ERK等调节BMSCS的分化，抑制破骨细胞来调节骨平衡。

Liu等[22]在OGD条件下研究淫羊藿苷对兔BMSCS的作用，发现淫羊藿苷通过对p-ERKS、p-P38、p-JNK的抑制来抵抗细胞自噬，进一步说明淫羊藿苷是通过MAPK途径来保护兔BMSCS的；Xu等[23]研究了淫羊藿苷对RANKL诱导的破骨细胞的影响，其结果表明淫羊藿苷对BMMS和RAW264.7细胞系的RANKL诱导的破骨细胞具有抑制作用，并且其作用有可能是通过对NF-kB和MAPK的活性来抑制的；陈喆[24]为了探究淫羊藿苷在单核细胞向破骨细胞分化的过程中对MAPK信号通路的影响，利用淫羊藿苷对RAW264.7细胞进行培养，发现淫羊藿苷对单核细胞的破骨分化具有稳定的抑制作用，且可以显著抑制p38、ERK、JNK的磷酸化水平。

4 Notch通路

Notch作为一种跨膜受体，同时也是一种转录因子，控制着细胞的生长以及分化，影响着胚胎形成、发育以及体内平衡，在哺乳动物中，有4种Notch基因和5种基因编码配体——3种Delta-like和2种jagged[25-26]。Notch的另一个特点是它依赖信号传递和信号接收细胞的內吞作用，这种內吞作用有着几种加工模式，来抑制或者激活Notch通路[27]。Notch是少数几条在多细胞生物的胚胎和成人发育过程中反复使用的信号通路之一[28]，它对T细胞的发育和功能起着至关重要的作用，与各种遗传疾病和癌症有关[25]，并且，Notch和骨质疏松的关系也非常密切[29]。Notch通路的机制是NECD（Notch extracellular domain）的 ECF（epidermal growth factor）重复序列与其配体（Delta-like，jagged）结合，然后ADAM/TACE（transmembrane proteases family）会 切割结合时暴露的金属蛋白酶位点，产生NECT（Notch extracellular truncation），NEXT 作为 γ-分泌酶的底物，与γ-分泌酶作用后裂解产生NICD（Notch intracellular domain），之后NICD进入细胞核与CBF1或RBPJ结合，在 MAML（Mastermind-like）和 p300 的作用下开始目标基因的表达，淫羊藿苷可以通过调节Notch通路组成成分jagged、CBF1等影响MSCS的分化。

徐娅等[30]为了观察淫羊藿苷对离体培养大鼠BMSCS的增殖、骨向分化能力，利用pNPP和ELISA手段检测ALP和BGP，应用Western Blotting方法检测Notch1和CBF1蛋白表达水平，结果显示各组的ALP、BGP显著提高，CBF1表达水平下降，表明ICA能够促进MSCs骨向分化，能通过下调Notch信号核心结合蛋白CBFl的表达抑制Notch信号通路；Xu等[31]报道淫羊藿苷可以显著提高成骨标记物的基因表达并增加MC3T3-E1和C3H10T1/2细胞的ALP活性，卵巢切除小鼠的Notch通路分子的mRNA水平升高，而在淫羊藿苷治疗之后表达水平显著降低，这些表明ICA通过抑制Notch信号传导途径，在体外促进成骨分化并在体内减轻骨质疏松症；Liu等[32]为了研究淫羊藿苷抗骨质疏松的机制，使用定量聚合酶联反应、蛋白质印迹等方法来观察对去卵巢大鼠Notch通路的影响，发现淫羊藿苷会下调骨组织中Notch1细胞内结构域和jagged1蛋白的表达，会减低Notch1细胞内结构域对Notch2mRNA表达的影响，以上结果说明ICA通过Notch信号通路来抑制间充质干细胞向脂肪细胞的分化。

5 Hedgehog通路

Hedgehog是以果蝇突变表皮的多刺外观而命名的，它在脊椎动物和无脊椎动物的发育过程中起着非常重要的作用[33]。Hedgeho（HH）由HH蛋白：Sonic HH （SHH）、Indian HH （IHH）、Desert HH（DHH）；修补受体（Patched receptor）；平滑受体（Smoothened receptor）；融合同源物的抑制剂（Suppressor of fused homolog）；驱动蛋白（kinesin protein）Kif7；蛋白激酶 A（PKA）和 GLI转录因子组成[34]，其中SHH对细胞的增殖、分化和正常发育起着关键的作用，与各种癌症有关；DHH仅作用于性腺，包括精子、卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞等；而IHH与血管生成及骨骼形成有关[35-37]。

淫羊藿苷主要通过调节IHH来促进成骨细胞和软骨细胞的分化，如Luo等[38]使用小鼠前交叉韧带横切术模型和小鼠软骨细胞来确定淫羊藿苷对骨关节炎的作用，发现淫羊藿苷可以显著减少软骨的变性，增加软骨的厚度，并且可以下调IHH和受IHH调控的基因，从而促进软骨细胞分化，这些说明淫羊藿苷可以减少骨关节炎小鼠模型的软骨破坏，促进软骨细胞分化；除了对IHH的调节外，淫羊藿苷也可以调控SHH的表达，如辛红美等[39]为了研究淫羊藿苷对MC3T3-E1前成骨细胞系增殖和分化的影响，利用CCK-8检测MC3T3-E1细胞增殖活性；使用茜素红染色方法（AR-S）检测成骨分化和钙结节的形成；应用Western blot方法检测osteocalcin、ALP、Shh蛋白表达，并测定ALP活性，结果显示淫羊藿苷可以显著促进MC3T3-E1细胞增殖，使ALP活性和蛋白表达量明显升高，综上可以判断ICA能够通过Hedgehog信号通路促进成骨细胞增殖和分化。

6 BMP/Smads通路

BMP是TGF-β超家族的一种组成成分，存在于细胞外基质中，通过与存在于细胞表面的受体结合来执行不同的功能。而Smad是BMP受体下游的转录调节因子，共有3种类型——R-Smads、Co-Smads、I-Smads，当BMP与其受体（BMP2等）结合之后，Smad1/5/8被激活，与Smad4作用形成二聚体，转移到细胞核，与Runx2等转录因子结合来调控基因转录，进而促进成骨细胞分化[40-41]。

淫羊藿苷可能通过信号级联BMPS/BMP2-Smad1/5/8-Runx2/Osterix来调控细胞的增殖与分化，訾慧等[42]发现淫羊藿素可能通过激活BMP/Runx2/Osx信号通路，上调Runx2、Osterix的转录表达，来促进大鼠BMSCS分化为成骨细胞；安庆等[43]利用淫羊藿苷培养MC3T3-E1细胞，发现淫羊藿苷促进成骨细胞的增殖与分化可能是通过激活BMP-2/Smads信号通路，上调Smad1/5/8等蛋白的表达来实现的；李雪等[44]通过在原代分离培养人牙周膜细胞中加入淫羊藿苷，发现淫羊藿苷可以上调Runx2、BMP2的基因和蛋白表达；笪巍伟等[45]通过淫羊藿苷干预前成骨细胞株OCT-1细胞，发现淫羊藿苷通过激活前成骨细胞中BMP信号通路，上调Runx2的表达，来诱导成骨细胞的增殖和分化。

7 PI3K/Akt通路

PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）位于细胞内，与癌基因的产物相关，有两个亚单位：P85、P110。Akt作为PI3K下游靶标，具有进化保守性，有着3种类型——Akt1、Akt2、Akt3，Akt1 在脑、心脏、肺中表达，Akt2在骨骼肌中表达，Akt3在脑、肾、胚胎心脏中表达，PI3K/Akt通路的激活机制是活化的RTK（酪氨酸激酶）将P85α-P110α异二聚体募集到细胞膜上，底物PIP2（磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸）被转化成 PIP3（磷脂酰肌醇三磷酸），PIP3会与Akt结合，使其转移到细胞膜上，在PDK1和PDK2的辅助下被激活，之后Akt会激活或失活下游因子，如NF-kB、AP-1、GSK3、Bad、FOXO、mTORh 和 HIF-1[46-48]。PI3K/Akt通路控制着细胞生长、增殖与凋亡，与肿瘤、血液疾病、神经系统等有关，近年来的一些药理实验表明，PI3K/Akt通路与骨的关系也非常密切[49-50]。

淫羊藿苷通过PI3K/AKT通路及其下游转录因子eNOS、mTOR等来调节BMSCS，如郭晓宇等[51]采用贴壁分离法培养BMSCS，采用PI3K阻断剂LY294002 和 Western blot法对 p-AKT、eNOS、iNOS进行蛋白定量分析，结果表明淫羊藿苷通过PI3K/AKT-eNOS途径促进BMSCs的成骨性分化；唐望[52]等利用兔的股骨骨髓来培养BMSCS，采用Transwell小室跨膜实验来观察Akt通路抑制剂LY294002对淫羊藿苷的影响，应用Western blotting方法来检测淫羊藿苷对PI3K及Akt蛋白的表达影响，其结果表明淫羊藿苷在体内外通过上调PI3K/Akt信号通路促进骨髓间充质干细胞迁移；Yao Xudong等[53]发现淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt/mTOR以及ERK1/2和JNK途径来预防铁过载引起BMSCS功能障碍。

8 PPAR-γ通路

PPAR-γ属于PPARs（过氧化物酶体增殖物激活受体）超家族的一员，是一种核激素受体和配体激活的转录因子，由A/B（配体非依赖性激活结构域）、C（DNA 结合结构域）、D（铰链结构域）和 E/F（配体结合结构域-LBD）等组成[54]，而PPAR超家族除了PPAR-γ，还有另外两个亚型——PPAR-α、PPAR-β/δ。PPAR-α主要在心脏、肝脏和骨骼肌中表达[55]；PPAR-β/δ 研究较少，主要在脂肪组织中表达，促进脂肪氧化；PPAR-γ主要在皮脂细胞和脂肪组织中表达，会控制脂肪细胞分化，抑制成骨细胞的表达，与糖尿病、心血管疾病、皮肤病关系密切[56]，而最新研究发现PPAR-γ可能是一个治疗新冠病毒的潜在靶点[57]。

淫羊藿苷通过PPAR-γ通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，抑制其成脂分化来治疗骨病，如谢小伟等[58]通过体外研究发现淫羊藿苷可以抑制Wnt通路，促进BMSCS的成骨分化，抑制PPAR-γ2的表达，并且与锶盐联用治疗股骨头坏死效果更好；Huang Zengfa等[59]通过体内外实验表明淫羊藿苷可以介导糖皮质激素诱导股骨头坏死模型的PPAR-γ通路来抑制BMSCS成脂分化，但具体机制还不明确；罗远等[60]以淫羊藿苷和骨质疏松小鼠为研究对象，发现淫羊藿苷可以抑制PPAR-γ表达。

9 cAMP/PKA通路

cAMP作为细胞内第二信使，通过调控PKA（蛋白激酶A）及其下游信号因子CREB（cAMP反应元件结合蛋白）参与肿瘤、认知功能、骨病等的调节，研究发现cAMP是介导成骨细胞表性改变的重要因子[61]。研究发现淫羊藿苷可以通过cAMP/PKA/CREB通路刺激骨形成，如Wengui Shi等[62]利用大鼠颅骨成骨细胞培养和大鼠骨生长模型，证明了淫羊藿苷通过cAMP/PKA/CREB通路刺激骨形成，且需要成骨细胞功能性初级纤毛的参与；Meng Chenc等[63]以BMP2诱导的C2C12成骨细胞为模型，发现淫羊藿苷可以激活cAMP/PKA/CREB通路来促进BMP2的表达，淫羊藿苷虽然是一种植物雌激素，但有可能并不是以其雌激素活性来调节成骨细胞的，石文贵等[64]研究淫羊藿苷处理的大鼠颅骨成骨细胞和人类乳腺癌细胞，发现淫羊藿苷虽能够促进MCF-7细胞ERα的核转位，但在OB细胞中淫羊藿苷却没有这种能力，说明淫羊藿苷并非通过经典的雌激素途径来促进骨形成的。

实际上，由于转录因子可能被多个通路共享，如Runx2参与了 Wnt/β-catenin通路、OPG/RANK/RANKL通路和BMP/Smads通路等，使得通路之间会有串扰，所以淫羊藿苷发挥其药理作用有时候不仅仅只通过一种通路，有可能是两种甚至两种以上，这种机制使淫羊藿苷的治疗作用被放大。除了上面提到的通路之外，与骨质疏松有关的通路还有EphB/EphrinB通路、NO通路、PTH通路、FGF通路、ERα-AMPK-Sirt1通路和Nrf2通路等，但由于淫羊藿苷在这些通路方面的研究较少，所以本文不对其进行详细描述。

10 讨论

综上所述，淫羊藿苷抗骨质疏松作用的信号通路主要有Wnt/β-catenin通路、OPG/RANK/RANKL通路、MAPK通路、Notch通路、Hedgehog通路、BMP/Smads通路、PI3K/Akt通路、PPAR-γ 通路、cAMP/PKA通路等，这些通路多且复杂，但都基本基于3种细胞——成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞。成骨细胞来源于间充质干细胞，主要作用是诱导新骨形成，一些重要的信号分子如 Runx2、Osx、β-catenin、AP-1等调控着成骨细胞的转化，成骨细胞还可以通过表达其表面的RANKL，来调控破骨细胞，进而参与骨重塑；破骨细胞来源于造血干细胞，通过分泌蛋白水解酶和盐酸来诱导骨吸收，一些炎性细胞因子，如IL-1、TNF-α等可以调节破骨细胞的分化和功能，当RANK与其配体结合后，MAPK、AKT/PKE等通路会被激活，来调节破骨细胞相关基因的表达；同样来源于间充质干细胞的脂肪细胞会和成骨细胞竞争，表达RANKL来促进破骨细胞的形成，PPAR-γ作为成脂转录因子，可以下调骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路，分别导致成骨细胞生成抑制和破骨细胞功能激活。

在临床应用上，淫羊藿苷可以显著提高骨密度，曾雪等[65]将90例骨质疏松症患者分为对照组和试验组，对照组给予骨化三醇软胶囊，试验组给予淫羊藿，30 d为一个疗程，三个疗程之后，发现试验组第4腰椎、股骨颈、桡骨远端骨密度大于对照组，表明淫羊藿可以显著提高患者骨密度。

除了具有抗骨质疏松的作用，淫羊藿苷还可以保护神经系统、保护心血管系统、提高免疫力等，具有很大的开发潜力。但也有一些不足，比如药动学实验发现淫羊藿苷在人体内未检测到原型，而在动物体内可以检测到，所以淫羊藿苷具体是如何代谢的还需要进一步研究，淫羊藿苷发挥药理作用时，信号通路变化的上下游效应因子还有待揭示，并且淫羊藿苷的有效剂量和安全性还有待考证，需要大量临床数据支持。