肿瘤相关巨噬细胞参与贝伐单抗耐药机制的研究进展

胡亚杰，韩天，陆滔，胡庆华

(1.中国药科大学药学院，江苏 南京 211198；2.上海药明康德新药开发有限公司，上海 200131)

在肿瘤血管生成过程中，多种细胞因子参与其中，如血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)。一种抗血管生成药物-贝伐单抗主要通过靶向VEGF-A发挥其抗肿瘤作用。临床上贝伐单抗的适应证包括宫颈癌、转移性乳腺癌及非小细胞肺癌等，该药现已被用于多种恶性肿瘤的治疗[1-2]。但是，在初始应答后大量患者表现出对贝伐单抗不敏感，或者表现为肿瘤耐药，之后肿瘤呈爆发式增殖，病情快速恶化，给临床治疗带来了巨大的困难与挑战。因此，阐明贝伐单抗的耐药机制，延缓、克服其耐药可提高贝伐单抗的临床疗效，有效延长肿瘤患者的生存期。在肿瘤微环境中，巨噬细胞是一把“双刃剑”，其主要分为两种类型，即M1型和M2型，然而这两种类型的巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥着相反的作用，M1型巨噬细胞起着“守卫者”的角色，通过介导细胞毒性而杀死肿瘤细胞；与之相反，M2型巨噬细胞促进肿瘤血管生成、以及肿瘤的发生和转移[3-4]。并且，这两种类型及其不同亚型之间可以相互转化，而TAM更偏向于M2型巨噬细胞。TAM广泛存在于不同肿瘤中，参与免疫应答以及肿瘤进展中的多个过程，并与肿瘤耐药的发生密切相关。然而，伴随着贝伐单抗的使用，巨噬细胞向M2型的转变促进了肿瘤的生长与转移，以及出现了贝伐单抗的耐药现象[5]。现就肿瘤相关巨噬细胞参与贝伐单抗耐药机制的相关研究予以综述。

1 肿瘤相关巨噬细胞

巨噬细胞在机体中发挥着重要作用，其被不同的细胞因子所激活进而转化为不同类型的巨噬细胞，如被干扰素-γ激活后，转化为M1型巨噬细胞，参与机体的免疫反应；被白细胞介素-4(IL-4)或IL-10激活后进而转化为M2型巨噬细胞，促进肿瘤的增殖与转移[6]。TAM的表型通常被认为更偏向于M2型，在肿瘤的增殖过程中扮演了重要的角色[7]。

在肿瘤生长和发育中，巨噬细胞的作用是复杂且多方面的。循环的单核细胞根据内部环境的条件产生成熟的巨噬细胞，当它们被招募到肿瘤微环境中，并在适当的条件下转化为TAM[8]。虽然有限的证据证明TAM可以直接杀死肿瘤细胞并刺激T细胞的抗肿瘤活性，但是多数研究表明TAM是肿瘤微环境的主要组成部分之一，是促进肿瘤发生发展的重要驱动因素[9-10]。例如，TAM通过分泌VEGF等细胞因子进而促进肿瘤血管的生成[11]。因此，越来越多的研究将TAM与肿瘤治疗联系起来，探究其在肿瘤治疗中扮演的角色及相关的作用机制。

2 贝伐单抗

贝伐单抗商品名为Avastin，是获得FDA批准上市的抗肿瘤血管生成药物之一。贝伐单抗是一种IgG1型抗体，其功能主要是与VEGF结合，防止激活其受体VEGFR-1和VEGFR-2，通过这种方式抑制肿瘤新生血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的[2]。目前，贝伐单抗已被广泛应用于临床，为恶性肿瘤的治疗提供了一种有效可行的治疗方案。自2004年上市以来，贝伐单抗深受临床治疗的青睐，这主要归功于它通过抑制新生血管的生成从而起到治疗肿瘤的作用，其对多种肿瘤的治疗均有效果，为恶性肿瘤的临床治疗做出了巨大的贡献。另外，贝伐单抗的给药间隔较长也使得其深受患者的喜爱[12]。虽然贝伐单抗已经上市很久，期间也有其他抗血管生成疗法的出现，但是这些优点使得贝伐单抗依旧深受医生和患者的青睐。临床治疗发现，早期使用贝伐单抗可以显著降低肿瘤血管密度，明显抑制肿瘤的发生、发展与迁移，对恶性肿瘤具有较好的治疗作用。但随着贝伐单抗给药进程的持续，许多患者出现明显的耐药现象。一些患者对贝伐单抗后期的不应答使得其病情反复，甚至严重恶化，这给临床治疗带来了极大的困难。因此，缓解和克服贝伐单抗的耐药问题将对肿瘤的临床治疗产生深远影响。

3 肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤发生、发展中的作用

3.1 肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤血管的生成 肿瘤血管是恶性肿瘤转移的主要途径，新生血管的生成需要多种细胞以及相关因子的参与[13]。研究发现，TAM通过分泌多种促血管生成因子，例如VEGF-A、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、细胞因子转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)等，促进肿瘤血管的生成[14]。

TAM主要是通过分泌上述描述的促血管生成因子，进而调控肿瘤新生血管生成[15]。在肿瘤低氧区域，TAM是VEGF-A的主要来源，研究表明巨噬细胞分泌的VEGF-A促进血管分支形成，帮助肿瘤新血管的形成[4]。这一现象在缺氧的环境中更为加剧，缺氧条件下主要通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIF)进行调节，如HIF-1α能上调巨噬细胞的VEGF-A的分泌量，从而促进新血管的生成[16]。同样的，来自肿瘤微环境中其他类型的VEGF也有助于肿瘤血管生长。基底膜的降解是肿瘤新生血管生成的重要过程，而TAM可以分泌蛋白酶从而加速这一过程，进而促进新生血管的形成，这些蛋白酶包括基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)、MMP-9等[17]。此外，TAM释放胸苷激酶磷酸化酶(TP)和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)通过刺激ECs的迁移，增加血管的侵袭和ECM的降解，从而促进肿瘤血管生成[16]。总的来说，这些证据表明TAM通过多种途径参与肿瘤新生血管的形成。

3.2 肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤侵袭与转移 肿瘤转移是指癌细胞从原发灶扩散到周围和远处的器官，TAM主要通过对肿瘤微环境的调控，从而来促进肿瘤的转移。研究发现，在缺乏局部血管生成的情况下，乳腺癌中肿瘤细胞的内渗与血管周围的巨噬细胞有关，这项研究支持了TAM刺激肿瘤转移的观点[18]。另外，在肿瘤微环境中，集落刺激因子1(colony-stimulating factor 1,CSF-1)表达会促使巨噬细胞的聚集和肿瘤转移这一进程的加快，在小鼠模型中，CSF-1的遗传消融可以降低结肠癌的恶性程度[19]。除此之外，CSF-1和EGF的表达促进了肿瘤细胞和巨噬细胞的迁移，而抑制两者可以阻止这两种细胞的转移[20]。TAM还可以通过分泌VEGF-C促进肿瘤的迁移，研究发现VEGF-C可以间接的促进淋巴结的转移[21]。

在肿瘤细胞迁移与侵袭过程中，细胞外基质(ECM)是一道坚实的“屏障”，而ECM的降解是肿瘤细胞转移的关键。TAM通过分泌多种蛋白水解酶，进而介导ECM降解和细胞与ECM间的相互作用，加速肿瘤的侵袭与转移[22]。另外，肿瘤相关巨噬细胞会分泌许多外泌体(exosomes)，这些外泌体被证明在肿瘤的发生发展中起着巨大的作用。在胃肠癌肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞会分泌大量含有载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)的外泌体，而这些外泌体与ApoE被证明能够通过激活PI3K-Akt通路并重排细胞骨架来促进肿瘤的转移与侵袭[23]。以上这些证据均支持了TAM促进肿瘤侵袭和迁移的观点。

3.3 肿瘤相关巨噬细胞介导肿瘤的免疫抑制 多项研究表明TAM参与肿瘤的免疫抑制，例如M2型巨噬细胞可以通过释放TGF-β和IL-10抑制T细胞的免疫反应，使得肿瘤细胞能逃避免疫细胞的监视[24]。另外有研究表明，调节性T细胞通过产生IL-10将巨噬细胞诱导为M2型巨噬细胞，而M2型巨噬细胞具有免疫调节和肿瘤促进的作用[25]。

虽然PD-1/PD-L1阻断可以激活T细胞，但是这一过程对TAM的作用研究较少。在为数不多的研究中发现，随着肿瘤进程的加重，TAM中PD-1的表达逐渐增加。研究人员通过体内阻断PD-1/PD-L1这一途径发现巨噬细胞的吞噬增加，并且这一过程的阻断抑制了肿瘤的生长[26]。以上证据证明了TAM参与肿瘤的免疫抑制过程。

4 贝伐单抗耐药机制的研究

目前，许多抗肿瘤药物的原发性或获得性耐药性是癌症治疗中的一个常见问题。虽然对于贝伐单抗的耐药已有一些研究，但具有普遍性的关键机制并未被阐明。目前研究较多的一些机制现介绍如下。

4.1 基因、代谢与血管拟态 随着基因组测序技术的进步，越来越多的研究将其应用在寻找潜在的分子靶标等方面。研究人员通过利用血浆DNA全基因组测序评估了使用贝伐单抗治疗的患者的肿瘤基因组，以确定与耐药性相关的新畸变，结果显示13q12.2扩增子在贝伐单抗治疗下出现且与其治疗耐药性相关[27]。这种新的耐药机制的发现将有助于贝伐单抗在转移性结直肠癌患者中的治疗。

在卵巢癌和乳腺癌细胞中，贝伐单抗耐药的肿瘤细胞显示糖酵解增加，研究表明使用抗血管生成药物后，肿瘤的代谢表型会发生改变[28]。研究发现，去除胶质瘤细胞中的氧化磷酸化途径会导致更多的糖酵解途径和耐缺氧表型以诱发贝伐单抗难治性肿瘤，该项研究证明糖酵解是肿瘤细胞逃避抗血管生成治疗的机制之一，并且提出抗糖酵解策略是克服贝伐单抗耐药性的有希望的方法之一[29]。

肿瘤干细胞可以促进肿瘤形成类似血管的管道结构，即血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)，相关研究认为巨噬细胞也能促进这一过程。这种管道结构虽然和血管有着相似的功能，但在超微结构上有着本质的不同，研究表明VM发生于缺氧的环境中，骨髓特异性HIF-1α的特定基因缺失导致VM网络形成减少。因此，HIF-1α可能是VM生成的关键性因素，并且可能与血管生成治疗的耐药性相关[30]。一项体外研究表明贝伐单抗在HCC1937乳腺癌细胞中未能抑制VM的生成[31]。同样的，在体内实验中，贝伐单抗在卵巢癌模型中表现出了抗肿瘤作用，但同时也加速了肿瘤的转移，并且在接受短期治疗的小鼠中出现了明显的缺氧和VM形成[32]。这些结果共同表明，贝伐单抗的耐药可能与VM的形成有关。

4.2 肿瘤微环境与缺氧 肿瘤微环境是肿瘤生存的必要条件，为肿瘤细胞的生长、播散提供着必要的支撑，近年来其已成为抗肿瘤研究的新“宠儿”。目前最普遍研究的一个机制是肿瘤内部的缺氧环境会影响贝伐单抗的治疗效果，并与其耐药有一定的联系。目前普遍认为使用抗血管生成药物治疗之后，肿瘤内部的缺氧环境会被加重，主要表现为HIF-1α的量升高，而贝伐单抗与HIF-1α拮抗剂的联用治疗在裸鼠中取得了很好效果，说明肿瘤部位的缺氧环境与贝伐单抗的耐药有一定的关系[33]。有一些研究表明，抑癌蛋白M和噬酸因子活化因子在缺氧的环境会被激活，进而促进巨噬细胞向M2型极化，通过阻断这两种因子可以提高贝伐单抗的治疗效果[34]。因此，对TAM的抑制可能是逆转贝伐单抗耐药的一个有效途径。

5 肿瘤相关巨噬细胞参与贝伐单抗耐药机制的研究

在早期的研究中发现抗血管生成治疗后肿瘤相关巨噬细胞增多，表明其可能参与了抗血管生成治疗的逃逸，并且推测TAM或许是一种潜在的耐药生物标志物或治疗靶点[35]。这项研究揭示了肿瘤相关巨噬细胞与贝伐单抗耐药性存在着一定的关联。

进一步，研究人员发现在贝伐单抗耐药的胶质母细胞瘤患者标本和两个新的异种移植瘤模型中，肿瘤相关巨噬细胞增加，并且证实了贝伐单抗耐药可能是由肿瘤边缘巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)减少导致M2型巨噬细胞增殖扩张驱动的，从而促进了肿瘤的生长[5]。同样的，在晚期结直肠癌患者肿瘤组织中，增加TAM浸润可降低贝伐单抗联合化疗的疗效，在接受贝伐单抗联合化疗的晚期结直肠癌患者中，肿瘤组织中TAM浸润可作为生物标志物[10]。这些研究证明了TAM参与了贝伐单抗的耐药，但是具体的机制尚不清楚。

最新的一项研究认为TNF-α是M2b型巨噬细胞分泌的关键促肿瘤效应分子，该研究证明了肿瘤相关巨噬细胞通过分泌TNFα和激活IDO1(吲哚胺2,3-双加氧化酶1，indoleamine 2,3dioxygenase 1)从而参与贝伐单抗的耐药机制，研究人员通过抑制TNF-α从而逆转了贝伐单抗的耐药[36]。

6 结语

肿瘤相关巨噬细胞在贝伐单抗耐药过程中起着关键性的促进作用，主要表现为TAM在肿瘤的生长与转移的过程中提供关键的细胞因子，尤其是可释放一些促进肿瘤血管生成、迁移、侵袭的因子。虽然已有相关研究证明了肿瘤相关巨噬细胞参与贝伐单抗的耐药机制，但是确切的机制仍需进一步探究。因此，通过探讨贝伐单抗耐药过程中引起的相关细胞因子增多的机制，以及这些因子对TAM的调控作用，从而为缓解和克服贝伐单抗及其他抗体类药物的临床耐药提供理论支持。