葡萄球菌生物膜形成机制及中药单体干预作用的研究进展

王小奇，宁毅，卢芳国

(湖南中医药大学医学院，长沙 410208)

葡萄球菌(Staphylococcus)是革兰阳性菌，是最常见的化脓性球菌，也是医院交叉感染的重要来源[1-2]。生物膜也称生物被膜，是能够附着在物体表面并被细菌胞外大分子包裹的有组织的微生物群落[3-4]。葡萄球菌生物膜内微生物产生的胞外聚合物主要由多糖、脂质和核酸、蛋白质形成，具有高度水合极性，可保护葡萄球菌免受药物的杀伤、破坏吞噬细胞、激活补体系统，以逃避宿主免疫系统的攻击，降低宿主免疫力、防止其他细菌入侵等[5-8]。多数感染性疾病尤其是持续性感染亦与葡萄球菌生物膜的形成有关，如心内膜炎、囊性纤维化肺内持续感染、人工关节置换术后感染、脓毒血症等[9-10]。由生物膜引起的持续性感染和多重耐药性已成为临床研究中备受国内外学者关注的公共卫生问题。

中药单体是一种通过多途径抑制葡萄球菌生长的多靶点天然活性药物，可抑制群体感应系统下调相关基因的表达，使其生物膜形成受限，也可通过水解葡萄球菌聚集与释放的关键蛋白以及破坏生物膜内部三维结构，使其无法形成完整的生物膜结构。现已发现中药单体小檗碱能够有效抑制葡萄球菌生物膜的生长[11-12]。现就葡萄球菌生物膜形成机制以及中药单体干预生物膜形成的相关研究予以综述，以期为抑制葡萄球菌生物膜形成的中医药研究提供新思路与新方法。

1 葡萄球菌生物膜形成过程及调控机制

葡萄球菌生物膜的形成是一个循环往复的动态过程，生物膜的生长周期分为初始黏附、定殖、成熟、扩散与分散4个阶段。葡萄球菌生物膜形成的初始阶段，菌体附着于物体表面发生可逆性附着。当葡萄球菌定植于物体表面后，葡萄球菌分泌胞外多糖并开始形成生物膜，葡萄球菌生物膜进入生长繁殖期，此时形成包含营养、通道、输送系统的三维结构，成熟的生物膜通过蔓延、向外扩展，细菌由内部脱落、重新定植于物体表面等过程再次形成新的生物膜[13-14]。葡萄球菌生物膜最外层形成的天然屏障能够抵御抗生素与药物的侵袭。生物膜内的细菌表现出极强的耐药性，其耐药性是浮游细菌的10～1 000倍[15-16]。葡萄球菌生物膜的形成并不是单一因素调控，而是多种因素相互作用的结果，研究葡萄球菌生物膜的形成机制有助于筛选抗葡萄球菌感染药物、提高药物利用率，对有效遏制葡萄球菌生物膜生成具有重要意义。在葡萄球菌生物膜形成过程中，具有重要调控作用的群体感应系统、全局性调控因子、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)等是目前的关注热点。

1.1群体感应系统 群体感应系统是细菌通过特定的信号分子浓度来感知周围环境中自身及其他菌群的数量，当菌体外的信号分子分布达到一定阈值时，菌体内的调控机制激活基因的表达与转录被激活，进而调控菌体密度适应环境的变化。群体感应系统作为一种细胞间的信号转导系统，对细菌生物膜的形成与分散具有重要意义[17-18]，群体感应系统能够调节生物膜形成后所产生的三维立体结构中的营养物质、代谢产物及废物的运输，主要通过调控细菌的群体行为，对外界环境的变化迅速做出反应，从而提高细菌应对恶劣生态环境的生存率。因此，群体感应系统在细菌生物膜形成过程中发挥重要的调控作用，不同种属的细菌通过激活不同的群体感应系统引发细菌聚集，进而诱导生物膜形成，其中葡萄球菌生物膜的形成由附属基因调节子(accessory gene regulator，Agr)的细胞内群体感应系统调控。Agr系统包括PⅡ和PⅢ两个启动子，其中PⅡ编码的蛋白构成了葡萄球菌的群感效应通路[19-21]。PⅡ有4个开放阅读框，分别编码AgrD、AgrB、AgrC和AgrA 4种蛋白。AgrD与AgrB负责信号分子自诱导肽(autoinducing peptide，AIP)的产生与加工[22-23]。成熟AIP分泌到细胞外，当胞外AIP浓度达到一定阈值时，AIP与受体组氨酸蛋白激酶AgrC结合，AgrC自动磷酸化后将磷酸基团传递给反应调控子AgrA，使其发生磷酸化修饰并被激活，激活后的AgrA与启动子PⅡ和PⅢ基因间区域结合并启动PⅡ和PⅢ基因的表达，PⅡ的表达能放大该通路中的信号转导，大量AIP产生使葡萄球菌发生聚集，从而介导生物膜的形成。Agr系统与葡萄球菌生物膜的形成和相关毒力因子的产生密切相关[24-25]，因此筛选安全、高效的群感效应抑制剂是干扰并阻断葡萄球菌生物膜形成的重要措施。抑制细菌群体感应的途径主要有：①降解胞外或细胞膜上的信号分子；②干扰受体蛋白与信号分子结合；③抑制胞内信号分子合成。中药含有多种天然的群体感应抑制剂，具有安全无毒、微量高效等作用特点，可通过高通量技术筛选其中的有效单体成分，进而深入挖掘其具体作用靶点，以揭示中药单体抑制生物膜形成与群体感应系统的相关性，为开发中医药类型的群体感应抑制剂奠定基础。

1.2全局性调控因子 全局性调控因子与葡萄球菌生物膜的形成密切相关，主要包括葡萄球菌辅助调节子A(staphylococcal accessory regulator A，SarA)及转录因子SigB(sigma B)。SarA受P1、P2、P3三个启动子调控[26]，可控制上百个葡萄球菌基因的表达，是公认的金黄色葡萄球菌的主要毒力基因表达调控系统，能够合成生物膜形成的初始阶段所需的连接蛋白，并促进或抑制相关毒素的生成[27]。SarA表达增强能显著促进葡萄球菌生物膜的生成，而SarA表达减弱则抑制葡萄球菌生物膜的生成。有研究证明，SarA突变葡萄球菌的生物膜生成量下降，其机制可能是SarA同时控制数个基因的转录，从而多靶点调控生物膜生成[28-29]，并不是仅依赖单一机制影响葡萄球菌生物膜的生成。SarA是细胞间黏附素(intercellular adhesion，ica)依赖型与非ica依赖型生物膜形成机制中的主要调节系统，SarA突变使ica表达降低，从而抑制生物膜的生成。同时，SarA能够正向调控生物膜相关蛋白的生成，从而促进生物膜形成[30]。SigB是细菌应对外界干扰时产生应激反应的主要调控因子，也是葡萄球菌毒力基因表达调控的主要因子之一。SigB作用于金黄色葡萄球菌生物膜形成的初始黏附阶段，能够上调毒素基因的转录及纤维蛋白的表达[31]，并与非ica依赖型调控系统密切相关[32]，可促进葡萄球菌生物膜生成；其次，SigB能够下调Agr系统中RNAⅢ的表达并降低胞外蛋白酶的活性，从而促进生物膜的生成[33]。

1.3ECM ECM是葡萄球菌生物膜的重要组成部分，主要成分包括胞外多糖、脂质、环境DNA(environmental DNA,eDNA)和表面蛋白等，其中以胞外多糖和蛋白质居多[34-35]。葡萄球菌定殖于物体表面后分泌大量ECM，ECM的数量随生物膜的形成与成熟而不断增加，对生物膜的形成发展及其结构的维持起到重要作用。ECM是保护葡萄球菌免受外界干扰的物理屏障，能够阻断外界抗生素以及有毒有害物质的入侵，提高生物膜内细菌在复杂环境中的抗逆性。icaADBC操纵子转录编码产生的多糖ica是金黄色葡萄球菌产生的胞外多糖[36-38]，它可以介导细胞间黏附，在生物膜形成的第一阶段起重要作用。临床菌株分离与鉴定发现ica基因阳性菌株的耐药性显著高于其阴性菌株,表明多糖ica在生物膜形成中的重要性。此外，eDNA也在葡萄球菌生物膜形成中起重要作用，其通过细菌主动分泌、细胞溶菌等方式释放到胞外，吸附在细菌表面并向外延伸，从而促使生物膜形成。eDNA不仅可介导黏附作用，还可与蛋白质交联形成类似纤维网的结构，在维持生物膜三维结构稳定性中发挥重要作用。抑制ECM的形成或功能被认为是抑制生物膜生成的有效方法之一。有研究表明，DNaseⅠ能够通过降解eDNA、分散素B降解胞外聚合物中互相粘连的一些多糖和蛋白质[39-40]，使完整的生物膜裂解，从而破坏生物膜的三维结构，逆转细菌的耐药性。

2 中药单体抑制生物膜形成

中药单体已成为继传统抗生素后治疗持续性感染等的又一研究重点。中药单体具有提取方式简单、提纯率高、进入菌体内作用途径多样化、作用靶点多、药理效应调节机制广等优点，在防治葡萄球菌生物膜引起的持续性感染疾病等方面具有独特优势。中药单体不仅可抑制葡萄球菌生物膜的形成，其与抗生素联用还可显著提高抗生素的利用效率，从而减少耐药性的产生。

2.1中药单体对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Stphylococcus aureus，MRSA)生物膜的影响 MRSA被称为“超级细菌”，是临床常见的耐药菌株，也是院内感染和社区感染的重要病原菌之一，其感染人体的皮肤及软组织后可导致社区性肺炎、严重败血症、感染性心内膜炎等。随着β-内酰胺酶类和碳青霉烯类等临床抗菌药物的广泛应用，MRSA耐药性明显增加，多重耐药和泛耐药菌株不断出现，危害日益严重。而生物膜的形成进一步加重了MRSA的耐药，给临床治疗带来极大困难，因此，开发中草药类的生物膜抑制剂对治疗MRSA导致的持续性感染具有重要意义[41-43]。李玲等[44]研究发现，小檗碱可抑制MRSA生长与生物膜形成，且0.2 mg/ml的小檗碱能够完全抑制MRSA的生物膜形成。覃静等[45]研究发现，8 μg/ml的大黄酸能够有效抑制生物膜内MRSA的生长，且大黄酸干预可使MRSA形态发生显著变化，并显著影响细胞通透性。由此可知，微量的大黄素可显著抑制MRSA生物膜形成，是潜在的MRSA生物膜形成的抑制药物。傅若秋等[46]研究发现，50 μg/ml花旗松素的抑菌率可达100%，且没食子酸、二氢杨梅素也有明显的抑菌作用，但该实验仅聚焦于中药单体的抑菌作用，其相关抑菌机制有待进一步研究。芦荟在人体内的生物利用率较高，是潜在的抑制MRSA生长的中药单体之一。周柳如和彭青[47]研究发现，芦荟大黄素对MRSA的抑制效果最强，最低抑菌浓度值为2～8 μg/ml，微量使用也可产生抑菌作用。Ning等[48]通过构建高特异性氧化石墨烯纳米生物传感器检测小檗碱作用后AgrA基因的表达，研究小檗碱干预后MRSA生物膜的形成机制，结果显示，随着小檗碱浓度的不断增加，AgrA基因的表达量不断下降，且生物膜的形成也不断减少，表明小檗碱通过抑制AgrA基因表达减少AIP的形成，从而抑制生物膜的形成。毕月等[49]发现，大黄素浓度为8 μg/ml时的MRSA菌体抑制作用显著，其机制可能是大黄素能够干扰MRSA的DNA转录及复制，从而抑制其蛋白质合成。张璐璐等[50]发现，穿心莲内酯与头孢西丁联用可明显抑制MRSA生长，而单用头孢西丁效果不显著，但与穿心莲内酯联用时作用效果明显增强，可能是穿心莲内酯破坏了MRSA生物膜，使头孢西丁利用率提高，起到良好的杀菌作用。

综上所述，清热、泻下中药中提取的单体能有效抑制MRSA菌体的生长。现已证明，小檗碱能够通过抑制Agr系统中相关基因的转录表达，干预MRSA生物膜的形成[48,51]。此外，中药单体与抗生素联用也能对MRSA生物膜形成产生明显的抑制作用，其机制可能是中药单体通过破坏生物膜所形成的三维结构，提高传统抗生素的渗透性，使其直接进入菌体并杀灭细菌，但中药单体对MRSA生物膜形成的调节机制及其具体药物联用机制还需深入研究。

2.2中药单体对金黄色葡萄球菌生物膜的影响 金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染的最常见病原菌，可形成生物膜定植于导尿管、心脏瓣膜等植入性材料表面，是造成持续性感染的主要病原菌之一[52]。金黄色葡萄球菌形成的生物膜具有高度耐药性，并对免疫系统的杀伤作用有较强的抵抗力，导致慢性化感染而难以清除控制。目前，抗生素仍是抑制生物膜形成的重要药物，由于抗生素的不合理使用，金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感性不断下降，并逐渐由单类耐药发展为多重耐药，且发生低耐药率到高耐药率的演变。由生物膜介导的多重耐药株的出现导致抗生素应用种类与应用剂量不断增加，这不仅加大了抗菌药物与细菌之间的自然选择，更进一步促进了细菌耐药性的产生。因此，开发新型、高效的中药单体类型的金黄色葡萄球菌生物膜抑制剂对逆转由生物膜产生的多重耐药具有重要意义。

尉景娟等[53]研究发现，中药单体丹参素及丹参酮ⅡA对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，并发现重楼皂苷、大黄蒽醌、黄芩黄酮、败酱草皂苷等单体对金黄色葡萄球菌生物膜有一定的抑制作用。Chen等[54]研究发现，与万古霉素相比，万古霉素联合中药单体黄芩素破坏金黄色葡萄球菌生物膜形成的作用更强，同时发现32 μg/ml与64 μg/ml的黄芩素能够下调群体感应系统中AgrA、RNAⅢ、SarA、ica基因的表达，从而破坏生物膜的形成，改变金黄色葡萄球菌生物膜的通透性，提高万古霉素的利用率，达到抑制细菌生长的目的。Mirzahosseinipour等[55]构建的二氧化硅纳米颗粒包被姜黄素的抗菌光动力系统在可见光激发、氧气存在时，可促使金黄色葡萄球菌产生氧自由基，抑制生物膜的形成。姜黄素-二氧化硅纳米系统对人正常成纤维细胞没有显著的细胞毒性作用，且具有促进创伤愈合的特性。Ma等[56]发现，装载姜黄素的壳聚糖纳米颗粒能够显著降低附着在物体表面的生物膜厚度，从而有效杀灭生物膜内包裹的金黄色葡萄球菌，在400 μg/ml浓度时，其对金黄色葡萄球菌的抑制率可达88.48%。Huang等[57]研制的以小檗碱和肉桂酸为原件的自组装纳米系统具有优良的抗菌活性，该纳米复合物对菌体的强吸附性和高渗透性，使其对MRSA较传统一线抗生素具有更好的抑制作用，且生物膜去除能力更强。中药单体可有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，但因其溶解性低，利用率不高。通过提高中药单体利用率增强中药单体的整体杀菌作用是现阶段的研究热点，已有研究发现，利用纳米材料与中药单体结合的靶向递药系统对抑制细菌生长等有显著作用，纳米材料与中药单体的结合能够提高中药单体的利用率，其与光热疗法结合后的杀菌作用明显提高。有文献报道，磁性氧化石墨烯结合光热疗法对分散态与聚集态MRSA的杀灭率分别达78%和97%[58]。但降低纳米材料毒性的方法以及递药系统的具体效应与机制仍需深入研究。

2.3中药单体对表皮葡萄球菌生物膜的影响 表皮葡萄球菌是滋生于生物体表的一类条件致病菌。近年来，由表皮葡萄球菌造成的医院感染日益加重，而表皮葡萄球菌在人工关节、留置静脉导管等医用生物材料表面形成的生物膜可有效抵御抗生素的治疗，导致感染迁延不愈，成为近年的研究热点。随着抗生素敏感性的逐年下降，越来越多的中药单体用于抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，并发挥了独特优势。

官妍等[59]研究发现，连翘苷能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，并降低表皮葡萄球菌的代谢活性，但其对生物膜形成初始阶段的抑制效果并不显著；同时，黄芩苷能抑制表皮葡萄球菌的生长。另有研究认为，苦参碱、鱼腥草素钠与红霉素联用能够增加细胞膜的渗透性，提高药物利用率，进而抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成[60]。王李俊等[61]发现，5.0 mg/ml的苦参总碱能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，其作用机制可能与苦参总碱(主要成分包含苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱等)下调 serp2195和gpxA-2的表达有关，苦参总碱可能通过抑制上述基因的转录表达，抑制表皮葡萄球菌生物膜的生成。易辉等[62]研究发现，隐丹参酮能够抑制表皮葡萄球菌ECM的形成并降低表皮葡萄球菌的代谢活性，进而抑制生物膜形成。但在生物膜逐渐成熟的过程中，低浓度的隐丹参酮不能起到抑制作用，表明随着表皮葡萄球菌生物膜的逐渐成熟，需使用高浓度药物才能有效抑制表皮葡萄球菌的生长，从侧面说明表皮葡萄球菌生物膜形成后的耐药性与抵抗药物的侵袭作用越来越强，由此可见，最佳的抑制生物膜形成的阶段可能是初始黏附阶段。金桂林等[63]研究发现，大蒜素与环丙沙星联用能够降低icaA基因的表达，从而抑制表皮葡萄球菌生物被膜的生长，这为临床用药提供了新的思路与方法，能够降低抗生素的使用量，减少耐药菌株的产生。雍江堰等[64]研究二氢丹参酮Ⅰ联合氨苄西林对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响，发现2 μg/ml二氢丹参酮Ⅰ与2 μg/ml氨苄西林联合应用能够有效抑制表皮葡萄球菌生物膜形成早期ECM的形成。姜大娥等[65]研究发现，土槿乙酸能够抑制表皮葡萄球菌生物膜的生长，但并不能直接杀灭细菌，其具体机制还需进一步研究。综上，上述多种中药单体联合抗生素抑制表皮葡萄球菌生物膜生长的研究仅为效应研究，其相关协同机制还需进一步探索。

3 小结与展望

目前，对葡萄球菌生物膜形成机制的探索取得了较大进展，但由于葡萄球菌生物膜耐药机制复杂，还需进一步对生物膜的相关性质特点、代谢及营养运输机制、聚合再定植机制、调控机制及其与人体免疫应激反应之间的关系等进行深入探索，这将为寻求药物作用靶点、控制微生物多重耐药提供理论指导。中药单体可通过抑制群体感应系统及SarA的表达、降解ECM来抑制葡萄球菌生物膜的形成。与单独使用抗生素相比，抗生素联合中药单体的抑菌效果更显著，但部分中药单体在抑菌作用中的利用效率非常低，且目前有关中药单体干预生物膜的研究大多为体外实验，尚不能模拟真实的体内抑制作用过程。因此，通过建立动物体内中药单体抑制生物膜生长模型对其作用的药效机制进行研究，尤其是干预胞内信号转导及相关调控机制将成为中药单体干预生物膜形成的研究重点。此外，利用纳米材料和中药单体进行自组装构建的精准靶向递药系统不仅可有效提高药物利用率、减少对人体的不良反应，还能在很大程度上防止耐药性的产生。未来，随着生命科学、化学生物学、材料学等交叉学科的发展，由生物膜导致的多重耐药问题终将得到解决。