双泵双柱UP-LC/MSMS法对烟熏肉制品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的稳定性分析*

2022-11-26曹俊杰董榕贵杨昌彪黄永桥简银池肖雄枫

贵州科学 2022年5期

曹俊杰，董榕贵，杨昌彪，于霞，马凯，黄永桥，简银池，肖雄枫

(1贵州省检测技术研究应用中心，贵州贵阳 550014；2贵州省分析测试研究院，贵州贵阳 550014)

氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素(以下简称氯霉素类)是一种对革兰氏阴阳性菌、杆副伤寒杆菌、沙门氏菌等有作用的广谱抑菌抗生素[1-2]，主要用于敏感细菌所致的禽肉、畜肉及水产品细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。氯霉素会抑制骨髓造血功能，导致再生障碍性贫血[3-4]，而甲砜霉素会抑制红细胞、白细胞和血小板的生成[5-6]，在国内外对其在动物体内的使用都有限量要求[7-10]。氯霉素在所有食品动物中不得检出，甲砜霉素在牛、羊、猪、鸡及其内脏和鱼的限量为50 μg/kg，氟苯尼考在畜禽肉、副产品和鱼肉限量200～2500 μg/kg，产蛋和奶产品不得检出。而氟苯尼考因对动物胚胎有毒理，在妊娠期动物禁用[11-13]。近几年，张凤清、张静、邹淼和庄姜云对液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织、牛奶、饲料和蜂蜜中的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素进行分析[15-19]。国家在烟熏肉制品[14]中规定了氯霉素的限量，但甲砜霉素和氟苯尼考未作要求。本文通过双泵双柱UPLC/MSMS法对烟熏肉制品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的稳定性分析，为批量样品的检测分析提供技术支撑，为规范烟熏肉制品行业的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

氯霉素(纯度99.24%，德国Dr.Ehrenstorfer)；氟苯尼考(纯度99.82%，德国Dr.Ehrenstorfer)；甲砜霉素(纯度99.24%，德国Dr.Ehrenstorfer)；甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸乙酯(天津科密欧)、氨水(25%～28%)、无水硫酸钠等均为分析纯；超纯水；氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯+氨水=100∶3)腊肉、香肠。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290-6470超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，配有ESI源(美国Agilent公司)Agilent1260二元泵(G1312B)；十通阀；Thermo Acclaim TRINITY P1离子交换色谱柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)；电子分析天平(上海卓精电子科技有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国 Millipore SAS公司)；L550台式低速离心机(湖南湘仪实验室开发有限公司)；XW-80A/80B旋涡混合器(上海米青科室实业有限公司)；OA-HEAT5085氮吹仪(美国OrgsnOmation)；0.22 μm滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司)。

(1)色谱柱条件：流动相A：超纯水，B：色谱级甲醇；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：5.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗脱程序

(2)质谱条件：离子源：ESI；扫描方式：负离子；监测方式：多反应监测(MRM)；干燥器温度：325 ℃；干燥气流速7.0 L/min，鞘气温度300 ℃，鞘气流速10 L/min，电子喷雾离子源(ESI-)雾化气流速1000 L/h。氯霉素类定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞能量见表2。

表2 氯霉素类的定性、定量离子对，去簇电压和碰撞能量

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的配置

氯霉素类混合标准储备液：准确称取适量的标准品，分别用甲醇配制成1.00 mg/mL，-18 ℃保存；10.00 μg/mL标准溶液配制：从1.00 mg/mL标准储备液中移取0.10 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，-18 ℃保存；50.00 ng/mL标准溶液配制：从10.00 μg/mL标准储备液中移取0.05 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，-18 ℃保存。

准确称取9份5 g阴性样品，2份作为基质空白对照，其余7份样品分别加入混合标准溶液50.00 ng/mL，体积分别为0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL，同样品一起处理。最终标准曲线的浓度分别是：0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、6.0 ng/mL、8.0 ng/mL、10.0 ng/mL。

1.3.2 样品处理

准确称取5 g试样，精确至0.01 g。置于50 mL离心管中，加入一颗瓷石，加入20 mL氨化乙酸乙酯，超声10 min、震荡2 min，4000 r/min常温离心5 min，取上清液10 mL转移至15 mL离心管中，40 ℃水浴氮气吹干，(1+9)乙腈+水定容5 mL，加3 mL正己烷去油脂，重复一次，过0.22 μm水系膜，上机待测。

2 结果与分析

2.1 样品出峰时间及定性定量离子谱图(图谱横轴为时间/min，纵轴为响应值/mAU)

图1 甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素的总离子色谱图

2.2 双泵的作用效果

双泵双柱和十通阀相结合，控制十通阀，来回切换进样柱和平衡柱，同一时间，一个泵带动一根柱子工作，另一个泵带动另一根柱子平衡。效率提高了一倍，缩短了检测周期。

图2 空白样品色谱图

图3 加标样品色谱图

图4 甲砜霉素特征离子色谱图

图5 氟苯尼考特征离子色谱图

2.3 样品提取与优化

样品在用乙酸乙酯提取的同时，加入瓷石，有利于充分均质样品，充分提取出目标物。由于烟熏制品中的油脂比较多，在去油脂净化时用50 mL的离心管，两次用饱和乙腈正己烷去油脂。从样品提取到分析样品的过程中，乙酸乙酸提取优于乙腈，减少对人员的伤害；加入瓷石有利于均质样品，使目标物得到充分的提取；取到离心管中直接氮吹，减少对器皿的污染，节约了成本。

图6 氯霉素特征离子色谱图

2.4 方法的线性范围及检出限

氯霉素类在0.5～10.00 μg/L的质量浓度范围内，呈现良好的线性关系，相关系数(R2)在0.997～0.998之间。不同化合物的曲线回归方程及相关系数如表3所示。同时按3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限。

表3 氯霉素类的线性范围、方程、R2、检出限和定量限

2.5 精密度实验和回收率

精选腊肉阴性样品，分别对氯霉素类进行加标回收实验和精密度实验，按0.2 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg进行加标实验，每个添加量水平做6个平行，按照1.3.2样品前处理方法进行提取净化。

空白样品和加标样品色谱图见图2和图3，结果见表4，三个添加水平的平均回收率为89.3%～103.7%，相对标准偏差(D)小于等于13.3%。

表4 氯霉素类回收率及相对标准偏差(n=6)

2.6 稳定性试验

精选腊肉和香肠的阴性样品，按照0.2 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg进行加标，每批添加水平做6个平行，添加4批，冷藏保存，以10天为周期进行实验，4个周期后分别对其含量进行检测分析。结果如表5、表6。

表5 第1天到30天回收率(n=6)

表6 第1天到30天相对标准偏差(n=6)

1)通过30天4次对香肠腊肉加标回收实验，回收率在80%～110%之间，满足检测实验要求。

2)从氯霉素类物稳定性开始是第1天，相对偏差小于14%；第10天相对偏差小于15%，第20天相对偏差小于14%；第30天相对偏差小于13%。总的相对偏差小于15%，可以得出氯霉素类物质在30天周期内稳定。

2.7 实际样品

共检测26批次烟熏制品，其中1批次检测出氯霉素，含量在1.3 μg/kg；检出氟苯尼考为2批次，含量在0.10～3.8 μg/kg；检出甲砜霉素2批次，含量在0.04～1.5 μg/kg。说明烟熏制品中存在氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素污染的风险。而且氟苯尼考和甲枫霉素含量较高，相关部门在烟熏品中没有规定限量。予以源头给予调控，市场流通给予控制。