宏基因组二代测序在结核性脑膜炎早期诊断中的应用

贾立斌，郑 榜，汪光柱，李润卓，杜工亮

（1.西安医学院研究生部，陕西 西安 710021；2.陕西省人民医院急诊外科，陕西 西安 710068）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染性疾病。在2019 年，全球约有1000 万人感染TB，造成了极大的社会经济负担[1]。结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是MTB 感染脑膜、脊膜诱发的亚急性或慢性非化脓性中枢神经系统感染性疾病[2]，是肺外结核最严重的一种类型[3]。TBM 多起病隐匿，早期的临床表现与其它类型脑膜炎相似，均可出现发热、头疼、呕吐等症状，而颈项强直、意识障碍等神经系统症状、体征则出现较晚；同时脑脊液抗酸染色涂片（acid-fast bacilli，AFB）、脑脊液MTB培养等方法灵敏度低、消耗时间长[4]。GeneXpert MTB/RIF（简称XpertMTB/RIF）是一种基于核酸扩增的肺外结核检测技术，具有快速、自动及灵敏度较高的优势，但其特异度较低，不能用做排除诊断[5]，而且这些检测方法在成人、儿童及合并人体免疫缺陷病毒感染（human immunodeficiency virus infection，HIV）者中的诊断效能亦不尽相同[6]，均给TBM 的早期诊断带来了极大的挑战。宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种高通量、无偏倚对样本中所含脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）进行平行测序，再通过生物信息分析得出病原微生物信息的技术，包括样本采集、核酸提取、文库制备、测序、生物信息分析及报告解读等步骤[7]。近年来，mNGS 逐渐被应用于中枢神经系统感染性疾病的早期诊断[8，9]，并取得了良好的效果。目前关于脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）mNGS 技术在TBM 早期诊断的应用研究虽然不多，但也取得了一些进展，现将脑脊液mNGS 在TBM 早期诊断中的应用综述如下。

1 mNGS 技术常用原理

自1977 年Sanger F 等[10]发明双脱氧链终止法进行DNA 测序以来，人类开始进入测序时代。核酸测序对生命科学、生物技术和医学发展的创造性和重要性，推动了人们对更高效、更准确和更低成本技术的不断探索。近些年来不断有新的技术平台诞生，包括核酸测序在内的基因组学在容量、速度及应用方面均有长足的发展[11]。目前，Illumina 公司的HiSeq、MiniSeq、NextSeq 等测序平台在市场上占主流地位，这些平台的测序原理均采用合成测序技术（sequencing by synthesis，SBS）[12]。

在DNA 复制过程中，DNA 聚合酶将自由碱基逐个连接，形成一条与DNA 模板链互补的新链。而SBS 的核心就是对DNA 模板链（即待测序DNA）和自由碱基的加工处理，即“DNA 簇”和“可逆性末端终止”技术[13]。DNA 簇是指每个DNA 片段等温扩增的过程。首先用超声波把待测序DNA 链打断成若干条都含几百个碱基的DNA 片段，其次在DNA 片段两端接入寡核苷酸接头，通过接头与寡核苷酸锚配对将片段固定到玻片表面后，解离双链，形成一端固定在玻片上的DNA 单链，然后另一端的接头与锚配对亦连接到玻片上，形成“桥”式结构，最后通过聚合酶链式技术（即桥式PCR 技术）制备成单克隆DNA 簇群。可逆性末端终止技术是将修饰（含不同颜色荧光标记及可逆性末端终止基团）的脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）作为底物完成单碱基配对、测序的方法，每次反应都包含DNA 聚合酶和修饰dNTP 的渗入、合成链延伸一个碱基、单碱基荧光显微镜采集荧光信号和已连接dNTP 恢复延伸功能及洗涤荧光标记的过程，重复进行渗入、延伸、采集、恢复4 个步骤，最后通过解读不同荧光颜色，获得DNA 的精准序列[14]。

2 脑脊液mNGS 在TBM 早期诊断中的应用

病原菌检测是目前确诊TBM 的主要方法。常用的TBM 病原菌检测方法有脑脊液AFB、脑脊液MTB 培养及XpertMTB/RIF 方法等。CSF 作为一种无菌性体液，在感染状态下，MTB 含量较少，AFB 检测阳性率较低，在Sun WW 等[15]进行的一项临床试验中发现其阳性率仅为2.91%；目前，脑脊液MTB 培养仍是TBM 诊断的“金标准”，但由于MTB 细胞壁的脂质含量相对较高，影响了营养素的吸收，导致细菌在培养基中生长缓慢，培养耗时在2～4 周以上，对TBM 早期诊断的价值有限[16]。XpertMTB/RIF 方法是一种快速、高灵敏度的核酸扩增试验，同时可进行利福平敏感性测验，2015 年WHO 推荐其用于TBM 的早期诊断，其结果阳性时可用于TBM 的早期诊断，但阴性结果不能用于排除诊断[17]。这些方法均不能满足临床诊断的需要，而mNGS 可以对血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、尿液、粪便、分泌物等多种标本进行细菌、病毒、真菌、寄生虫及非典型病原微生物的无假设、快速、平行检测，尤其对培养困难、病情危重的感染性疾病有独特价值[18]。从2014 年Wilson MR 等[19]首次使用mNGS 诊断1 例钩端螺旋体脑膜炎的重症免疫缺陷儿童以来，脑脊液mNGS技术逐渐开始应用于TBM 的早期诊断领域。

2.1 成人TBM 早期诊断 一直以来，TBM 的早期诊断都是困扰临床医生的难题，而早期诊断对于减少TBM 患者的致死率和神经系统后遗症又有相当重要的价值[2]。2020 年Xing XW 等[20]报道的脑脊液mNGS 用于213 例中枢神经系统感染患者诊断的前瞻性病例研究中，在TBM 组中（共44 例TBM 患者），当以属特异性读数量≥1 为阳性标准时，mNGS的真阳性率为27.3%，真阴性率为96.4%，总符合率为82.2%，受试者工作曲线的曲线下面积最大（0.619,95%CI=0.516～0.721）；44 例患者的脑脊液AFB 及MTB 培养结果均是阴性，脑脊液Xpert MTB/RIF 阳性率为16.13%；联合mNGS 和Xpert MTB/RIF 阳性率为29.55%；虽然脑脊液mNGS 的阳性率仍不高，但高于现有的其它检测手段，且其特异性较高，可用于TBM 的早期诊断和排除诊断。Lin A等[21]报道的一项前瞻性队列研究显示，对50 例不合并HIV 的怀疑TBM 成人患者进行脑脊液mNGS 检测，20 例检测出MTB；以传统的诊断方法（包括脑脊液培养和AFB 染色）和Xpert MTB/RIF 为金标准，22 例患者确诊为TBM，其中mNGS 的敏感性为63.6%（14/22）；以最终临床诊断为金标准，在22 例确诊TBM 患者和12 例临床诊断TBM 患者中，mNGS 的敏感性为58.8%（20/34），16 例排除TBM患者中，mNGS 结果均为阴性，特异性为100%，而传统诊断方法和Xpert MTB/RIF 的敏感性分别为29.4%（10/34）、38.2%（13/34）；mNGS 诊断的敏感性高于传统诊断方法及Xpert MTB/RIF 法。Sun W 等[22]的关于mNGS 用于诊断肺外结核的回顾性研究显示，mNGS 对TBM 的敏感性明显高于其它肺外结核病，达到了84.44%，提示mNGS 对不同类型标本的MTB 诊断效果不同，以脑脊液最佳，而且对比抗结核治疗前、后mNGS 的阳性检出率，提示抗结核治疗对mNGS 的敏感性无明显影响。

2.2 儿童TBM 早期诊断 儿童神经系统、细胞免疫系统发育不完全，导致MTB 侵入儿童中枢神经系统后起病隐匿，早期临床症状多不典型，加之患儿配合程度差，体液量相对较少，及传统的脑脊液AFB 和MTB 培养法在儿童中的敏感性远低于成人，这些均给儿童TBM 的早期诊断增加了难度[23]。张芙蓉等[24]报道的1 例以“头晕1 周、呕吐4 天”为主诉的10 岁患儿，初步考虑为颅内占位，入院后病情进展迅速，意识障碍加重，完善脑脊液常规、生化检验及颅脑MRI 检查后考虑为中枢神经系统感染，而第1 次结核菌素试验、结核感染T 细胞试验、脑脊液AFB 均为阴性，给予抗病毒治疗后，患儿症状无明显改善，随后脑脊液mNGS 检测，检测到MTB 基因序列，且未检出其它病原微生物序列，给予抗结核治疗后症状很快好转，最终诊断为TBM 合并血管炎，提示脑脊液mNGS 可应用于儿童不典型TBM 的早期诊断。钱乔乔等[25]收集的5 例9 月龄～13 岁患儿中，临床表现不典型，脑脊液生化检验不是TBM 典型表现，多次行AFB 均为阴性，行脑脊液mNGS 检查后均检出MTB，诊断为TBM，其中有1 位患儿因病情危重，家长放弃治疗后死亡，余给予抗结核治疗后症状均明显好转，表明mNGS 有助于早期精准诊断TBM，改善患儿预后。

2.3 合并HIV 的TBM 早期诊断 TBM 可以影响所有人群，但在HIV 患者和儿童中尤其常见[26]。由于免疫功能缺陷，HIV 患者合并TBM 的可能性是其他患者的5 倍，病死率可达60%[6]，而早期识别、早期诊断及适当的治疗是改善预后的基础，因而早期诊断TBM 对合并HIV 患者尤为重要。在诊断过程中，应注意患者的免疫功能状态，因为免疫缺陷对不同诊断方法的敏感度及特异度均有一定的影响。Chen J等[27]对88 例疑似中枢神经系统感染的HIV 患者进行的一项回顾性性研究中，通过脑脊液涂片、培养及mNGS 等方法有73 例最终实现病原微生物的诊断，其中mNGS 诊断50 例，阳性率为56.8%，包括巨细胞性脑炎、单纯性疱疹病毒性脑炎、隐球菌性脑膜炎等，同时mNGS 确诊患者CD4+T 淋巴细胞计数明显低于未确诊者，mNGS 可能更适合CD4+T 淋巴细胞计数低的患者；在18 例以症状、其他实验室检测和试验性治疗的效果诊断为中枢神经系统感染的患者中，mNGS 未发现病原体，其中包括8 例临床怀疑为TBM 患者（AFB 及XpertMTB/RIF 均为阴性），mNGS最常见的漏诊疾病是临床怀疑的TBM；回顾其mNGS 检测方法，考虑与脑脊液样本核酸提取方法有关。结核杆菌是一种胞内菌，需要采用特殊的破壁方式，才能提取出结核杆菌DNA。

3 脑脊液mNGS 应用于TBM 早期诊断存在的不足

虽然mNGS 技术在TBM 早期诊断中发挥着愈发重要的作用，但在其使用过程中仍存在很多不足。①样本离心处理：MTB 是一种较难进行核酸测序的病原菌，其在脑脊液中繁殖速度慢、细菌含量少，导致mNGS 阳性率不高。Ji XC 等[28]对脑脊液样本进行离心，提取上清液用于测序，减低了人源基因的比例，提高了mNGS 对MTB 的灵敏度。故对高度怀疑TBM 者，先进行脑脊液样本离心处理，选用离心后上清液进行mNGS，以提高测序灵敏度；②样本破壁处理：mNGS 首先要尽可能获得样本中所含的全部核酸信息，而MTB 作为一种胞内菌，其细胞壁厚，常规破壁方式处理后其核酸释放效率低，是导致MTB 检出率低的1 个重要原因，因此，应对临床上不能排除MTB 感染者，加用特殊破壁方式处理样本，以提高MTB 检出率；③测序结果可靠性：测序结果可靠性主要由最小测序深度所决定[14]。最小测序深度是指测序过程中某段序列被检测到的最少次数，以确保获得全部基因信息。最小测序深度越大，其可靠性就越高，同时成本亦越高，所以确定不同体液样本的最佳最小测序深度就尤为重要。目前，脑脊液的最佳测序深度没有明确的界定，临床医生及科研人员应进一步开展大型前瞻性试验研究，从而明确脑脊液的最佳最小测序深度，从而控制成本，提高脑脊液mNGS 的准确性；④阳性结果的判定：目前检测结果解读缺乏统一标准，需要专业的微生物专家根据本实验室具体情况解读，带有一定的误判率，应建立临床医生与微生物专家之间的高效联络，尤其是检测出多种病原菌，在判定致病菌时，从而做出更真实的判定；对MTB 等较难测序的微生物，检出一条特异序列即可认定为阳性，但仍需根据临床症状及检测结果判定是否有多重感染可能；⑤指导用药：mNGS 与培养不同，不能进行细菌体外药敏试验，直接指导临床用药；但对TBM 患者，诊断耐药结核分枝杆菌对降低其死亡率至关重要[29]。可对检测出的MTB 进行已知耐药基因靶向测序，筛选出耐药基因，再根据药敏检测表型结果，得出关键的耐药基因，结合药物的作用机理和耐药基因的耐药机理，给出用药建议，同时可进行体外验证。

4 总结与展望

近年来随着社会的进步、医药卫生事业的发展，TBM 的发病率较前有所下降，但其对人类健康的危害不容小视，尤其目前TBM 的早期诊断方法仍存在许多不足之处。近年来随着mNGS 技术的不断发展，逐渐从实验室走向临床应用，其在TBM早期诊断方面表现出许多优势，但仍需要更多的临床研究来证明其效用，同时制订统一的操作标准及结果解读指南，进一步降低成本，更好的服务临床。