冷冻卵巢组织移植研究进展

华蓬勃，杨怡卓，李芳菲，彭红梅*

(1.北京市门头沟区妇幼保健院，北京 102300；2.中国人民解放军总医院第一医学中心，北京 100039)

不孕症目前已成为继癌症、心血管疾病的第三大疾病，全球包括我国的患病率逐年增高，其中卵巢因素导致不孕是主要原因之一。卵巢早衰、卵巢先天发育异常、妇科恶性肿瘤放化疗后导致卵巢不可逆的损伤、其他系统恶性肿瘤全身治疗后卵巢无功能等导致越来越多的年轻患者失去生育能力及面临内分泌失调等问题，从而给自身及家庭的生活带来压力。目前保存生育力的方式有卵子冷冻、胚胎冷冻、卵巢移植等，其中胚胎冷冻及卵子冷冻已相对成熟[1]，而卵巢移植与其他两种方法相比，有其特有的优势，不仅可以为年轻患者保留生育功能，还可以解决其内分泌相关问题。

随着器官移植技术的飞速发展，卵巢移植是逐渐兴起的一种挽救卵巢早衰、卵巢恶性肿瘤等年轻患者生育能力的手段。但目前卵巢移植临床实践应用中仍面临诸多问题，例如移植后大量卵泡的丢失导致卵巢寿命较短甚至移植后卵巢无功能、异体移植术后因免疫排斥反应可能需要长期口服免疫抑制剂以及伦理问题等诸多因素，均限制了卵巢移植的进展，需要更多的临床研究推动卵巢移植的发展。本文综述了冷冻卵巢组织移植的研究进展，包括卵巢组织移植的类型、移植部位的选择、如何改善移植成功率、移植后的免疫抑制剂的应用等。

一、卵巢组织移植的类型

卵巢移植类型包括：自体移植、同种异体移植、异种移植。

1.自体移植：对于恶性肿瘤需要全身放化疗的患者，可以在治疗前进行卵巢组织冷冻，在放化疗结束后进行自体卵巢移植。其优点为无免疫排斥反应、无需使用免疫抑制剂、术后并发症少，但对于卵巢无功能的患者或患有某些恶性肿瘤，其卵巢组织中存在恶性肿瘤的患者等均无法行自体移植。2021年我国首例骨髓异常增生综合征的患者在骨髓移植后进行自体卵巢移植，术后3个月恢复自然月经，术后1年余后顺利妊娠并分娩活婴[2]，为自体卵巢移植的发展奠定了基础。

2.同种异体移植：对于卵巢早衰、无功能的患者，或患有某些恶性肿瘤，其卵巢组织中存在恶性肿瘤的患者等，均无法进行自体移植。此类患者要想解决内分泌及生育需求，可以进行供卵-体外受精胚胎移植以及激素替代治疗。但是对于存在激素替代治疗禁忌症的患者，可以考虑异体移植，同时解决内分泌以及生育需求。我国1996年陈诵芬等[3]对1例男性假两性畸形患者行同种异体卵巢移植术，患者术后3个月月经来潮，术后1年卵巢仍存在功能。2009年Silber[4]对其中一人患有卵巢早衰的10对单卵双胎姐妹进行了研究，双胎姐妹间的同种异体卵巢移植让卵巢早衰姐妹获得了10次自然妊娠，最终7例活产。此研究的成功，为单卵双胎的姐妹之一出现卵巢功能衰竭提供了较好的治疗方案，既可以恢复卵巢功能，又避免了长期口服免疫抑制剂以及激素替代治疗。但对于想要对无血缘关系的患者间进行异体卵巢移植，均需面临长期口服免疫抑制剂以及伦理等相关问题。

3.异种移植：目前尚无人类相关的异种卵巢组织移植相关报道。

2021年Dolmans等[5]回顾了欧洲五大中心285名妇女冷冻卵巢组织移植的结局，几乎所有接受自体卵巢组织移植的妇女都能看到内分泌功能的恢复，大约25%的妇女会生下一个健康的孩子。这些研究数据，标志着生殖技术的飞速发展，且捐赠器官爱心人士较前明显增多，均为卵巢移植的发展奠定了基础。

二、冷冻卵巢组织移植部位的选择及方法

卵巢移植的部位可以分为两大类：原位移植以及异位移植。无论是自体移植、同种异体移植以及异种卵巢移植，移植部位的选择及方法是一致的。

1.原位移植：将卵巢组织移植回至原始卵巢所在的盆腔中，称原位移植。原位移植的卵巢组织被重新植入其原来的生理环境中，更有利于卵泡的生长发育，且可不需要辅助生殖即可自然受孕，如需促排、取卵、体外受精等辅助生殖操作也更容易简便。但也有其劣势所在，如患者盆腔粘连较重，将导致手术困难甚至无法进行原位移植。卵巢组织的原位移植一般在术后 2～9个月可检测到卵巢活性，最多可持续7年之久，此类研究已获得多个成功妊娠的案例[6]。

卵巢组织原位移植常见的部位为卵巢表面原位移植、阔韧带腹膜口袋移植等。卵巢表面原位移植要求患者至少存在一侧卵巢，可将患者卵巢皮质层切开，暴露髓质的整个血管网络，将卵巢皮质用7-0或8-0 propylene线固定，或简单放置在卵巢髓质上，表面覆盖Interceed[7]。2011年Donnez等[8]报道了一例特纳综合征患者进行同种异体双胞胎卵巢皮质原位移植，移植后3个月实现卵巢功能恢复，常规周期7个月后，发生自然妊娠，孕38周时分娩了一名体重2 850克的健康女婴。

如患者无双侧卵巢可行阔韧带腹膜口袋移植，在阔韧带前叶做一个腹膜窗口，可见血管网区域，供者皮质碎片放置在窗口中，随后覆盖Interceed[9]。

2.异位移植：将患者卵巢组织移植到盆腔以外的部位，称为异位移植。其手术操作简单，对于盆腔粘连较重的患者或恶性肿瘤放疗后盆腔血供条件较差的患者，均无法行原位移植，可行异位移植。但异位移植也有其劣势所在，其生存的微环境不利于卵泡的生长发育以及恢复卵巢功能，且术后无法自然受孕，均需进行辅助生殖。

卵巢皮质异位移植常见部位为前臂、大腿、腹直肌与鞘之间等。2001年Oktay等[10]报道了2例恶性肿瘤患者进行卵巢皮质异位移植到前臂的成功的案例。因当时缺乏大龄患者的卵巢组织冷冻技术，所以在放化疗前将患者的卵巢皮质自体异位移植至前臂，避开放疗区域后进行放化疗，成功保留了患者的内分泌功能。具体方法：将切除卵巢制备成16条卵巢皮质，在腕桡肌前窝下方5 cm处做一个1 cm的垂直切口，采用缝合拉穿技术在皮下插入卵巢带。2012年Kim[11]报道了5名癌症患者卵巢组织异位移植的寿命研究，用3-0 Vicry缝线将8～10片卵巢皮质贯穿于线上，局麻下切开皮肤约2 cm切口移植到腹直肌与和鞘之间，进行患者内分泌的监测，最长维持了7年。

因异位移植将会有空卵泡的大量产生、卵泡的停止发育、受精率的降低等等问题，其原因可能与环境温度的不同、血供的不同等相关，截止至目前研究报道异位移植后活产率很少。2015年Youm等[12]分析比较了小鼠卵巢移植的原位移植及异位移植，结果表明原位移植的卵泡存活多，移植成功率更高。

三、添加外源性物质来改善移植的成功率

冷冻卵巢组织移植成功率受多种因素的影响，其中最重要的是冷冻及移植过程中卵泡的丢失的问题。卵巢组织移植后，局部缺血可持续3～7 d，这种缺血导致的卵泡丢失仍然是目前卵巢组织移植面临的严峻问题。移植后决定卵巢寿命的重要因素是存活下来的原始卵泡的数量[13]，而冷冻卵巢皮质中较多休眠卵泡在移植后丢失，因此尽可能在此时期减少卵泡的损伤至关重要[14]。随着国内研究的进展，冷冻卵巢组织移植后卵巢功能恢复的成功率以及之后的妊娠率及活产率均较以往明显上升[15]，为卵巢冷冻移植技术的发展打下了基础。为尽量减少冷冻以及移植过程导致卵泡的丢失，可增加外源性物质来改善移植的成功率。既往有多项研究报道，具体如下。

1.生长因子：卵巢皮质移植因没有血管吻合，移植后的存活与否在于血运重建，所以移植后加快血运重建、减少组织缺氧时间可以减少卵泡的丢失。目前有多种生长因子可以促进血管的生成，研究较多的有血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等。

VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质的变性、内膜细胞的迁移、增殖和血管形成等作用。VEGF是一个家族，VEGF-A是其一员，可以促进新生血管形成和使血管通透性增加，为一种有效的血管生成因子，进而提高移植卵巢组织的卵泡存活率[16]。bFGF一般由巨噬、平滑肌、内皮细胞分泌，bFGF可以促进血管的生成。bFGF可以增加卵巢组织CD31表达，使同种异体移植卵巢组织中卵泡密度明显增加[17]。2013年有研究将小鼠进行同种异体卵巢移植后使用VEGF、bFGF以及两种生长因子联合，观察对卵泡的存活及血管重建的作用，结果表明单独使用bFGF或VEGF均可以促进卵巢血管的重建，两种生长因子联合应用效果更佳[18]，可以使血管的密度与卵泡数量明显增多，两种生长因子起到了协同的作用。

2.激素因子：在卵巢组织移植过程中，多项研究表明各种激素的使用对卵泡的存活也发挥了很好的保护作用，包括卵泡刺激素(FSH)、雄激素、人绝经期促性腺激素(HMG)、抗苗勒管激素(AMH)、黄体生成素(LH)等。在移植前用FSH或HMG培养卵巢组织，可使移植后卵巢组织的VEGF和bFGF的表达增强及血管密度增加，从而提高卵泡生存率[19]。AMH在控制性分化和卵泡发育起关键作用[20]，虽然AMH长期以来作为卵巢储备的一个重要指标，但最近也被作为一种保护剂研究[21]。有研究表明使用AMH可以明显减少卵巢移植后的卵泡丢失[22]。既往有研究报道小鼠的卵母细胞在雄性受体中可以成功受精后活产，雄性小鼠体内的激素环境可以支持具有发育能力的卵母细胞的生长[23]。而在人类卵巢移植中，雄激素的应用还没有相关报道，需进一步研究。2020年Zheng等[24]报道LH可通过在卵巢冷冻保存和移植过程中上调VEGF、Cx43和Cx37的表达来促进卵巢的存活和功能。

3.1-磷酸鞘氨醇(S1P)：S1P是一种抑制凋亡的因子，抑制放化疗引起的细胞凋亡[25]。2011年有研究报道S1P对人卵巢移植后早期血管生成的影响，结果表明S1P可以增加血管的密度、促进血管的生成，进而改善人卵巢皮质组织移植过程中的原始卵泡存活率[26]。也有研究报道对冷冻卵巢移植的小鼠进行S1P干预，发现进行S1P干预的小鼠原始及初级卵泡较多，抵抗移植对卵巢的损伤，降低了移植后卵泡凋亡的发生率[27]。还有研究提出，卵巢玻璃化冻存过程 中FSH 联合 S1P的干预可抑制卵泡闭锁[28]。

4.间充质干细胞(MSCs)：MSCs通过释放血管生成因子、分化多种组织细胞，在支持新血管生成和稳定方面起重要作用。MSCs可以提高VEGF、血管生成素的水平，刺激新血管形成，并增加冷冻保存的卵巢组织移植后的血液灌注，明显降低原始卵泡的死亡率从而减少了卵泡的丢失[29]。有研究在大鼠卵巢自体移植过程中加入脂肪MSCs后，原始卵泡及卵泡总数均较无添加卵巢移植组增多，而细胞凋亡数目减少，表明大鼠脂肪MSCs可以改善卵巢移植的成功率，延长移植后的卵巢寿命[30]。异体移植尚未见相关报道，但异体移植可考虑使用MSCs提高移植成功率。

5.富含血小板的血浆(PRP)：PRP中血小板浓度非常高，其生长因子浓度可为血浆的3～5倍，其中的各种生长因子在细胞分化与增殖中起着非常重要作用，还可以促进血管的生成[31]。在既往不同的研究中，各种医学领域均有应用PRP来促进血管生成并取得成功的案例。富含血小板的纤维蛋白(PRF)是一种富含血小板的血液衍生物。PRF释放细胞因子，可以诱导血管生成，抑制氧化应激、细胞凋亡和炎症，从而减少缺血再灌注损伤。2019年国外有研究对自体卵巢移植的小鼠在移植部位使用PRF生物支架，结果显示其细胞凋亡率和炎症因子浓度显著降低[32]。

6.抗氧化因子：内源性抗氧化因子可以中和在缺血应激期间过量产生的氧自由基。目前应用的外源性抗氧化剂有抗坏血酸、褪黑素、维生素C、维生素E等，能减轻一定的程度的血管内皮损伤，但目前应用有限，有较大的争议[29]。褪黑素在线粒体水平上具有抗炎及抗氧化作用，2021年国外有研究将雌性大鼠的卵巢进行褪黑素介质中冷冻，与标准冷冻法相比，卵巢移植的质量更高[33]，关于生育能力的影响有待进一步研究。

四、异体卵巢组织移植后的免疫抑制剂的应用

自体卵巢组织移植或单卵双胎姐妹间的异体卵巢组织移植因无免疫排斥反应，无需使用免疫抑制剂。但无血缘关系患者间的异体卵巢组织移植及异种卵巢组织移植，因免疫排斥反应必然存在，均需长期口服免疫抑制，所以免疫抑制剂的应用是保证移植成功的关键因素之一。由于卵巢并非人体救命的器官，而免疫抑制剂又均有各种毒副作用，进而限制了人类异体卵巢移植的进展。最理想的移植方案应该是安全的，确保受者可以长期接受供体的卵巢，恢复内分泌功能及完成生育需求。那么安全有效的免疫抑制剂的应用，显得非常重要。虽然目前没有成熟的免疫抑制方案应用于卵巢移植，但目前国内外肝脏以及肾脏的移植非常普遍，免疫抑制剂应用非常成熟，且均有较多肝、肾脏移植后患者成功妊娠活产的案例。

目前临床应用的免疫抑制剂大致分为6类：细胞因子合成抑制剂，包括环孢菌素(CsA)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素(RAPA)等；DNA合成抑制剂，包括硫唑嘌呤(AZA)、霉酚酸酯(MMF)、咪唑立宾(MZR)等；肾上腺皮质类固醇药物，如甲基强的松龙、强的松等；抗淋巴细胞抗体类药物，如甲氨蝶呤、环磷酰胺等；植物药类，包括FTY720、雷公藤多苷等。由于目前已发表的关于人类的同种异体卵巢移植研究较少，免疫抑制剂应用经验不足，尚无统一意见。

1.环孢菌素A(CsA)：在1987年有研究对大鼠进行卵巢输卵管同种异体移植，使用CsA作为免疫抑制剂，术后成功产下后代[34]。在1993年有研究对兔子进行同种异体卵巢移植，同样将环孢素作为免疫抑制剂，应用环孢菌素组与未应用组比较，存活率及成功率明显升高[35]。其主要毒副作用为肾毒性、高血糖、高血压、高血脂等。

2.他克莫司(FK506)：作用机制与CsA类似，目前已成为肾移植、肝脏移植受体的主要免疫抑制剂。2020年我国发表的12例肾移植患者术后成功妊娠，孕期的免疫抑制方案为他克莫司和泼尼松以及硫唑嘌呤，分娩的新生儿均无出生缺陷，随访一年余，子代的生长及心理发育、学习能力及智力与同龄人均无明显差异[36]。其主要毒副作用有高血压、头痛、低磷血症、震颤、骨质疏松等。

3.霉酚酸酯(MMF)：可选择性抑制T、B淋巴细胞的增殖和功能。2020年国外报道了2例恒河猴子宫异体移植后成功恢复功能，应用了霉酚酸酯(MMF)、环孢菌素以及他克莫司免疫抑制治疗，术后无排异反应，2个月后恢复月经[37]。其主要毒副作用为败血症、感染、白细胞降低等。

4.肾上腺皮质激素：具有溶解免疫活性细胞、阻断细胞分化从而达到抗炎、抗免疫的作用。我国早在1996年发表了一例人类卵巢成功移植的案例报道[3]，研究中是一位男性假两性畸形患者进行异体卵巢移植，使用的免疫抑制剂为环磷酰胺、地塞米松及强的松，术后未出现排异反应，1年后卵巢功能仍正常。其主要副作用为骨质疏松、电解质紊乱、高血压、高血糖、肌肉萎缩等。

5.免疫调节剂胚胎植入前因子(PIF)：PIF也可以防止器官排异反应并且恢复器官功能[38]。PIF是一种由活胚胎分泌的肽，该肽的功能包括无抑制的免疫调节和无排斥的移植接受。2018年有研究采用PIF作为单一疗法使进行同种异体卵巢移植的狒狒成功恢复了卵巢功能[38]，但其狒狒为野外获得，不除外其遗传的相关性，需要更多的实验研究证实其可行性。

五、小结与展望

卵巢移植技术可以让患者获得生育以及内分泌功能，但仍有很多需要待解决的问题，例如如何减少卵泡丢失而提高移植后卵巢的长期功能，如何更好地使用免疫抑制剂，既能达到抗免疫排斥反应，又能减轻患者以及后代的影响。目前卵巢组织移植仍然是一种正在发展中的技术，但深入的研究可能会将这项技术发展成一种成熟的保护生育能力的方法。