氯喹及羟氯喹在风湿性自身免疫病中的研究进展

韩晓晓 邓国民

氯喹(chloroquine, CQ)及羟氯喹(hydroxychloroquine, HCQ)属于4-氨基喹啉的衍生物，化学结构相似，均具有芳香结构及碱性侧链，通常以对映异构体 S (+) 和 R (-)混合物的形式存在。CQ以磷酸盐形式给药，而HCQ以硫酸盐形式给药，通常在上肠道被吸收，整体生物利用度较高(0.7～0.8)，血液中分布容积较大(CQ为 65000L，HCQ为 47257L)，可广泛分布到全身肌肉、肝脏、脾脏、肺、肾脏及黑色素水平较高的皮肤及眼睛等组织中[1]。药物的半衰期相对较长(40～60 天)，并且大部分通过肾脏排泄，其余通过肝脏代谢或通过粪便排泄[2, 3]。CQ在1934年被合成，是一种效果明显并且可被大规模生产的抗疟药物，但由于其存在胃肠道并发症、视网膜病变、心脏毒性等诸多毒性而停止了进一步的研究。与CQ比较，HCQ的毒性作用明显减轻[3]。

在第二次世界大战期间，接受预防性抗疟疾治疗的美国士兵的关节炎和皮疹的症状及严重程度明显降低，进而导致了抗疟药物对风湿性自身免疫病(rheumatic autoimmune diseases, RAD)的疗效及应用的进一步研究。RAD是一类由于机体的免疫系统障碍而累及多脏器、多系统的疾病，主要包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、强直性脊柱炎、骨关节炎、痛风、原发性干燥综合征(primary Sjögren syndrome，pSS)等风湿性疾病。本文就主要针对CQ及HCQ在风湿病中的作用机制及相关的不良反应进行总结，进而为其应用至除疟疾及风湿病以外的疾病提供依据。

一、作用机制

CQ及HCQ在自身免疫性疾病中的治疗作用与其抗炎及免疫调节作用相关。它们可通过抑制内溶酶体活性、炎性细胞因子的释放、NADPH 氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, NOX)的活性及钙 (Ca2+)动员等多种途经发挥对风湿病的治疗作用。

1.抑制溶酶体活性和自噬：自噬是一种保守的细胞内降解途径，可将受损或不需要的细胞质物质和细胞器输送到溶酶体进行降解以维持细胞的稳态。在自噬期间，细胞质货物被称为自噬体的双膜囊泡隔离，自噬体-溶酶体融合以产生自溶酶体[4]。自噬体-溶酶体融合和溶酶体降解活性的受损会阻止自噬。呈弱碱性的CQ及HCQ在溶酶体中积累可引起pH值升高，进而减低溶酶体酶的活性而抑制自噬。此外，CQ还可以破坏溶酶体膜的稳定性，促进细胞内溶酶体酶的释放，干扰溶酶体酶的活性而抑制自噬。

在RAD中，自噬过度激活可引起Th17细胞数量的增加和Treg细胞数量的减少而导致T细胞群的不平衡，引起IL-17 和 IL-6等炎性细胞因子水平升高及TGF-β等抑炎性细胞因子水平降低[5]。An等[6,7]研究发现，在SLE患者及在狼疮易感性MLR/Ipr小鼠中，HCQ可通过抑制自噬的过度激活而重新平衡Th17/Treg比例，降低血清中炎性细胞因子水平，恢复免疫平衡而减轻病情的严重程度。Park等[8]通过体外T淋巴细胞分化模型及炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)的动物模型发现,CQ以Nurr1依赖性方式促进调节性T细胞的分化，同时抑制Th17细胞的基因表达，进而发挥对自身免疫性疾病的治疗作用。

此外自噬及溶酶体途经在抗原加工和 MHC Ⅱ类分子的递呈过程中发挥着重要作用，HCQ可通过抑制溶酶体及自噬体的成熟而干扰巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞等抗原递呈细胞向T淋巴细胞递呈外来抗原及自身抗原，抑制适应性免疫反应，进而发挥对RAD的治疗作用。

2.抑制炎性细胞因子:Toll样受体(toll-like receptor, TLR)主要包括TLR3、7、8、9等，是进化上的保守分子，可专门识别常见的微生物模式，引起抗原递呈细胞的活化，增强T淋巴细胞和B淋巴细胞的抗原递呈，在先天性和适应性免疫应答中发挥着重要作用[9]。CQ及HCQ可通过干扰TLR信号而发挥抗炎作用。聚肌胞苷酸可诱导的TLR3的激活，小核核糖核蛋白颗粒(small nuclear ribonucleoprotein particles, snRNP)中特定的、高度保守的RNA序列可以刺激TLR7和TLR8而激活先天免疫细胞。此外，针对snRNP的自身抗体可能通过刺激TLR7/8引起系统性红斑狼疮的发病[10]。TLR9的胞外域需要在内溶酶体中被切割激活后才具有识别外来核酸的能力，抗原递呈细胞CpG-DNA的非特异性内吞作用和内体成熟对于TLR9信号转导至关重要[11]。CQ及HCQ可通过干扰内体pH值的变化而抑制TLR的加工及活化。此外，HCQ可通过与TLR 配体(如核酸)相互作用以改变核酸二级结构而阻止其与TLR的结合，进而抑制内体中TLR的激活[12]。最终，CQ及HCQ可通过干扰TLR信号的转导而抑制免疫细胞激活，进而降低外周血单个核细胞中干扰素(interferon, IFN)-γ、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)、白介素(interleukin, IL)-1、IL-6和IL-2等炎性细胞因子的水平，进而发挥对RAD的治疗作用[13]。

CQ及HCQ可通过抑制环GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)发挥抗炎作用。cGAS是一种细胞质DNA传感器，其与 DNA 结合后可催化合成cGAMP，cGAMP作为第二信使可结合并激活Ⅰ型干扰素刺激器(stimulator of interferon genes, STING)以诱导干扰素等细胞因子的表达[14]。cGAS在部分SLE患者中上调，CQ及HCQ可抑制 cGAS 与其配体(例如DNA)的结合而减少IFN-β的表达，进而发挥抗炎作用。

CQ及HCQ还可通过干扰细胞内信号而抑制佛波酯诱导的花生四烯酸的合成及TNF-α和IL-1等炎性细胞因子的产生。在THP-1 巨噬细胞中，HCQ可通过剂量依赖的方式抑制Ca2+激活的K+通道而减少K+流出，导致IL-1等炎性细胞因子释放减少[15]。

3.抑制 NADPH 氧化酶：NADPH 氧化酶是6个亚基组成的蛋白质膜结合酶复合物，可将分子氧转化为超氧化物，参与了TNF-α和IL-1β等炎性细胞因子诱导的信号级联反应。HCQ通过阻止了NOX的催化亚基gp91phox从细胞溶质转移到内体膜，妨碍了NOX的正确组装和激活，阻碍了下游细胞事件和炎性细胞因子TNF-α和IL-8的产生。HCQ还抑制了TLR8从ER到内体的重新分布，进而发挥免疫抑制作用[16]。内体中NOX的激活会导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，在SLE患者中，高ROS水平严重降低了一氧化氮(nitric oxide, NO)的生物利用度，导致内皮功能障碍。在NZBWF1狼疮小鼠模型中，HCQ通过下调NOX的活性，升高NO的生物活性，降低ROS的产生而改善内皮的功能状态[17]。此外，在抗磷脂综合征小鼠模型中，HCQ可通过增加p-eNOS/eNOS 比率，促进NO的产生而改善小鼠的促凝状态及血管功能。

4.抑制钙动员：Ca2+是激活信号通路和转录因子的第二信使，从内质网(endoplasmic reticulum, ER)和细胞外到细胞质中的Ca2+动员以及随后的Ca2+依赖性信号转导在T淋巴细胞和B淋巴细胞的信号通路中发挥着重要作用，可参与调节免疫因子的表达和分泌[18]。T淋巴细胞通过细胞表面的T细胞受体(T cell receptors, TCRs)识别抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)递呈的抗原并被激活, 细胞内储存和细胞外环境中的Ca2+动员引起了TCRs下游信号级联[19]。而CQ及HCQ以剂量依赖性方式阻止Ca2+动员进而抑制T淋巴细胞的增殖及多种细胞因子的释放[20]。CD4+T细胞上的共刺激分子CD154是B淋巴细胞激活所必需的，其表达受活化T细胞核因子 (nuclear factor of activated T cells, NFAT)控制，NFAT的核移位依赖于从ER释放的转录因子Ca2+[21]。HCQ通过阻止Ca2+从ER释放而抑制NFAT核易位，导致CD154基因表达降低进而下调T细胞上CD154的表达和活性，抑制B淋巴细胞激活。总之，这些研究表明HCQ可通过阻断Ca2+从ER释放而抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的多级活化及细胞内信号的转导，抑制免疫反应，进而发挥对RAD的治疗作用[20]。

二、不良反应

CQ及HCQ作为改善风湿病情的药物可发挥免疫调节作用而非免疫抑制作用，不良反应的发生率较低，具有良好的安全性。一般来说，HCQ<6.5mg/(kg·d)的剂量和 CQ<3mg/(kg·d)的剂量可以被患者很好地耐受[3]。但在长期给药过程中，仍可引起严重的不良反应。CQ及HCQ常见的不良反应包括胃肠道反应，如恶心、呕吐、腹泻。此外，HCQ可与黑色素强烈结合，易沉积在皮肤和眼睛等含黑色素的组织中，因此可引起皮肤、皮疹等皮肤病变及视网膜病变。此外，CQ及HCQ还可引起神经肌肉病变及心脏毒性。本文就CQ及HCQ引起的视网膜病变、心血管病变及神经肌肉病变等最严重和危及生命的不良反应进行总结。

1.视网膜病变：视网膜病变是CQ及HCQ引起的最严重的并发症。CQ及HCQ引起的视网膜病变主要累及外层视网膜(光感受器)，可引起外层视网膜变薄，进而出现外黄斑变薄的特征性牛眼模式。一项回顾性研究表明，HCQ引起视网膜病变的危险因素包括HCQ的高剂量[>5mg/(kg·d)]及长期(>5年)使用、高累积剂量(超过600～1000g)、3～5 期慢性肾病和他莫昔芬联合用药(>6个月)等[22]。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞中光感受器的降解可参与视力的维持及保护，而HCQ可通过抑制RPE细胞中的溶酶体降解及内吞作用而减少光感受器的降解，同时视网膜上皮细胞中外段的不完全消化可产生脂褐素，进而引起光氧化物的积累，导致视网膜的进行性退化及视网膜病[23]。此外，RPE细胞中表达的有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptides, OATPs) 1A2可介导细胞摄取视黄醇的前体全反式视黄醇 (all-trans-retinol, atROL)，CQ及HCQ可抑制人胚胎肾细胞293及人RPE原代细胞中OATP1A2的功能，进而造成atROL在细胞外的积累而破坏经典的视觉周期，引起视力的损害[24]。

2.心血管病变：CQ及HCQ可引起心律失常及心肌病两组心血管并发症。大多数心脏毒性作用与高浓度、长时间给药相关。CQ及HCQ可阻断钠离子通道及钙离子通道，破坏心肌细胞的膜稳定性，引起房室传导阻滞及QRS间期加宽的传导障碍等心律失常[25]。长期应用CQ及HCQ可引起溶酶体的降解活性下降，导致糖原和磷脂等物质的积累，引起肌原纤维紊乱，造成心肌病及心肌纤维化。此外，CQ及HCQ引起的自噬体积累可引起中毒性心肌病。

3.肌病:CQ及HCQ可通过降低溶酶体酶的活性，引起自噬体的积累，进而可导致肌肉毒性合并周围神经功能障碍,其引起的肌病可表现为进行性的、无痛的近端肢体无力，伴有腱反射减弱但感觉仍然保留。即使是长期治疗及高累计剂量引起的肌病也会在停药后迅速消退[3]。

4.CQ及HCQ与妊娠:尽管CQ及HCQ可穿过胎盘，但在评估人类使用治疗剂量(CQ为250mg/d；HCQ为200～400mg/d)时，胎盘和脐带血中的药物浓度是相似的。乳汁中的分泌量很低，不超过 0.2mg/(kg·d)；此外，一项研究发现，患有风湿病的母亲在怀孕期间接受HCQ治疗，其婴儿未检测到明显的畸形、新生儿感染、视网膜毒性、耳毒性和神经发育，说明妊娠期及哺乳期应用HCQ治疗似乎是安全的[26]。SIGLEC1又称为唾液酸黏附素和 CD169，是SLE 患者IFN特征中最显著上调的基因之一，并且与疾病活动相关。抗 Ro/SS-A 自身抗体阳性的孕妇中的SIGLEC1表达升高可使自身免疫性先天性心脏传导阻滞 (congenital heart block, CHB)的风险升高，HCQ可以通过减少Ⅰ型 IFN的表达而预防CHB的发生[27, 28]。

三、临床应用

CQ及HCQ被广泛地应用于RAD的治疗。在SLE患者中，HCQ可单一给药或者联合糖皮质激素及免疫抑制剂给药。一项多中心队列研究表明，HCQ治疗可减轻SLE患者的症状并提高其长期生存率[29]。在RA患者中，CQ及HCQ可通过抑制软骨分解，阻止关节破坏进而延缓疾病进展。研究表明，HCQ可通过结合酸性蛋白聚糖，使其免受蛋白水解酶的降解，进而在软骨中积累[30]。因此，HCQ及CQ可通过抑制引起软骨降解的IL-17 等炎性细胞因子的产生而预防关节的进一步损伤[31]。此外，HCQ治疗可延缓RA患者的疾病进展并且有利于缓解RA相关的心血管和肾脏疾病[32]。在 pSS 患者中，一项多中心的回顾性研究表明，HCQ可减轻 pSS 患者的关节炎、疲劳、紫癜、雷诺现象及高丙种球蛋白血症等腺体外症状，此外， HCQ可改善患者的唾液分泌状况，缓解其口腔症状[33]。研究发现，HCQ可能通过抑制胆碱酯酶的升高而改善唾液的产生。除风湿性自身免疫性疾病以外，CQ及HCQ还可用于皮肤病、COVID-19、癌症及糖尿病等疾病的治疗。

四、展 望

CQ及HCQ由于价格低廉、安全性良好、患者耐受性高及多效性被广泛用于RAD的治疗，是许多风湿性疾病的治疗基础。CQ及HCQ可通过抑制溶酶体活性及自噬、阻断内体TLR、cGAS 和 NOX以及 Ca2+动员，下调炎性应答反应，进而发挥对免疫系统的调节功能。此外，HCQ虽然被认为安全性较高，不良反应发生率较低并且在妊娠期及哺乳期使用被认为是安全的，但不良反应仍然存在，其中最严重的是视网膜病及心肌病。高剂量或者高累积量的HCQ不仅会抑制溶酶体活性，而且会引起内体中的pH值升高，进而导致更多的不良反应[22]。美国眼科学会建议HCQ治疗开始时进行基线眼科检查，以减少HCQ应用引起的视网膜损害。CQ及HCQ引起的肌病在停药后会下迅速消退，HCQ引起的中毒性心肌病在早期发现也可能是可逆的，这说明了早期及时诊断的重要性。未来应着眼于开发CQ及HCQ更多的生物的调节途经，同时也可通过化学改进的方式使其更有效且毒性更小，进而增加治疗益处和减轻不良反应，最终改善患者预后。