线粒体自噬信号通路在年龄相关性眼病中的研究进展△

魏 苗 黄泽宇 李鹏飞 管怀进 季 敏

线粒体自噬是一种通过特殊自噬-溶酶体降解途径清除功能障碍和受损的线粒体的过程，其主要类型有泛素依赖性、非泛素依赖性以及脂质介导的线粒体自噬。线粒体自噬能阻止活性氧(ROS)的产生，并抑制营养物质(如氧气)的无效消耗，进而促进细胞生存[1]。目前，线粒体自噬在肿瘤、细胞衰老、代谢性疾病等众多疾病研究中已经取得了突破性的进展[2-3]。

线粒体功能障碍伴随着大量与年龄相关的病理条件，因此，研究线粒体与年龄相关性疾病的关系十分必要[4-5]。线粒体能量代谢受损与年龄相关性疾病具有共同的病理特征，包括线粒体DNA(mtDNA)突变率增加，电子传递链功能减弱，ROS水平升高，促凋亡因子释放增强等[6]。既往大量研究表明，线粒体活性下降在年龄相关性疾病中起重要作用[7-8]。在衰老过程中，由于自噬的年龄依赖性衰退或自噬的严重缺陷，细胞和组织中功能失调的细胞器不断积累，使机体能量失衡[9]。有研究报道，衰老小鼠心肌细胞、骨骼肌卫星细胞线粒体自噬通量下降。老年人体肌肉卫星细胞和心肌细胞同样显示线粒体自噬清除减少[10]。在老年人肌肉中，线粒体自噬相关基因BCL2/腺病毒E1B蛋白相互作用蛋白3(BNIP3L)和细胞质E3-泛素连接酶(Parkin)表达下调[11]。这些结果表明，线粒体自噬的缺陷与衰老和年龄相关性疾病密切相关。然而，线粒体自噬在年龄相关性眼病发生发展中的机制尚未明确，本文将对近年来线粒体自噬调控途径以及在年龄相关性眼病中的研究进展进行综述。

1 线粒体自噬调控途径

1.1 泛素依赖性线粒体自噬第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)诱导的激酶1(PINK1)/Parkin信号轴是目前研究最为广泛的线粒体自噬途径。在正常生理情况下，PINK1和Parkin通过线粒体靶向序列持续靶向正常的线粒体[12]。在病理情况下，线粒体膜电位去极化阻止PINK1进入内膜，在线粒体外膜(OMM)大量聚集磷酸化泛素，促进Parkin由胞浆向线粒体膜转位，激活线粒体自噬[13]。泛素化标记的OMM蛋白结合不同的LC3相互作用区(LIR)，包括泛素结合蛋白p62、视神经蛋白(OPTN)、核点蛋白质52(NDP52)，降解受损的线粒体[14]。此外，PINK1还通过产生磷酸化泛素(pUb)直接招募OPTN、NDP52等受体启动线粒体自噬[15-16]。这些线粒体自噬过程都是依赖Parkin的存在。

1.2 非泛素依赖性线粒体自噬BCL2相互作用蛋白3(BNIP3)和BNIP3L是与线粒体抗凋亡蛋白BCL2 BH3结构域同源的蛋白质，通过LIR基序与LC3家族蛋白相互作用[17]。BNIP3 LIR基序周围的Ser17和Ser24位点磷酸化有助于其与LC3B结合[18]，BNIP3L在Ser34和Ser35位点的磷酸化也增强了其与LC3B的相互作用[19]，诱导线粒体自噬。除了与LC3B直接相互作用外，BNIP3还从以下三个途径间接诱导线粒体自噬：(1)BNIP3与PINK1相互作用，促进其在OMM上的积累，从而促进PINK1/Parkin依赖的自噬[20]。(2)BNIP3通过诱导线粒体动力相关蛋白1(DRP1)易位，促进线粒体裂解、Parkin募集，激活线粒体自噬。(3)泛素化BNIP3L作用于PINK1/Parkin的下游，将NBR1招募至线粒体，从而靶向线粒体降解。综上所述，BNIP3诱导的线粒体自噬和PINK1/Parkin自噬之间可能存在协调作用[21]。

FUNDC1是OMM的自噬受体。正常情况下，FUNDC1分别被Src蛋白激酶和CK2蛋白激酶在Tyr18和Ser13上磷酸化，减少与LC3的相互作用。在缺氧或羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)处理时，线粒体磷酸酶(PGAM5)与FUNDC1的Ser13位点结合并去磷酸化，增强与LC3的相互作用，促进线粒体自噬[22]。此外，FUNDC1在缺氧初期被MARCH5在Lys119处泛素化降解，剩余的FUNDC1在长时间缺氧条件下参与线粒体自噬[4]。

BCL2样蛋白13(BCL2L13)是酵母自噬蛋白Atg32的哺乳动物同源物，在OMM中广泛表达并定位，其N端暴露于细胞质中。它是一个非典型的BCL2家族蛋白，包含四个BH基序。这些BH结构域参与线粒体碎裂和靶向线粒体至自噬体。BCL2L13诱导的线粒体自噬不依赖DRP1和Parkin途径。它的LIR区域直接与LC3相互作用，使线粒体被吞噬膜识别，启动线粒体降解途径[23]。

1.3 脂质介导的线粒体自噬最近研究发现，脂质可作为一种消除信号，介导损伤线粒体向自噬途径的募集。神经酰胺和心磷脂是参与线粒体自噬启动的线粒体脂质。在线粒体应激条件下，主要位于OMM的线粒体神经酰胺合成酶1(CerS1)合成神经酰胺，与LC3相互作用，诱导线粒体自噬。同样，心磷脂通常存在于线粒体内膜(IMM)磷脂中，向OMM转移是脂质介导线粒体自噬的独特机制。心磷脂通过与LC3直接相互作用导致自噬。

2 线粒体自噬与年龄相关性眼病

年龄是导致年龄相关性眼病不可改变的危险因素，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、原发性开角型青光眼(POAG)和糖尿病性视网膜病变(DR)等。Wang等[24]使用靶向代谢组学分析6周和73周龄C57BL6/J小鼠的眼部代谢产物发现，老年小鼠视网膜电图反应减弱，视网膜感光细胞数量减少，视网膜、脉络膜和视神经的线粒体和葡萄糖代谢失调。

2.1 Fuchs内皮角膜营养不良Fuchs内皮角膜营养不良(FECD)是一种年龄相关的角膜内皮细胞(CECs)退行性疾病，好发于50岁以上的女性。在FECD中，CECs表现出应激诱导的衰老、氧化应激、DNA损伤、线粒体功能障碍以及持续的内质网(ER)应激。其中，涉及线粒体动力学改变的线粒体自噬在FECD发病机制中起重要作用。

Benischke等[25]最先在FECD患者组织中发现自噬小体囊泡吞噬肿胀的线粒体。在紫外线(UVA)诱导的FECD小鼠模型[26]和早发FECD小鼠模型[27]中也报道了线粒体异常积累，线粒体自噬启动。早发性FECD小鼠模型以及UVA诱导的FECD小鼠模型中的线粒体自噬机制尚不清楚，体外研究也较少，需进一步探究[28]。Miyai等[28]研究表明，人类FECD样本显示PINK1、磷酸化Parkin的表达上调，总Parkin降低，线粒体自噬增强。FECD细胞系也显示出总Parkin显著降低，CCCP处理时，磷酸化Parkin(Ser65)表达上调。为了研究Parkin募集后线粒体的泛素化和蛋白酶体降解情况，研究者使用环氧霉素后发现Fuchs细胞系在CCCP治疗后总Parkin增加。为了进一步研究，使用自噬抑制剂后内源性PINK1和总Parkin减少，随后逆转了Ser65的增加[29]。这些结果表明，Parkin依赖的线粒体降解参与了FECD的发生发展。

2.2 年龄相关性白内障

2.2.1 BNIP3/BNIP3L信号通路在年龄相关性白内障中的作用年龄相关性白内障(ARC)是世界范围内失明的首要原因，其基本病理改变是晶状体透明度下降，由透明变混浊。晶状体的成熟依赖于晶状体上皮细胞(LEC)向晶状体纤维细胞的不断分化。新形成的晶状体纤维细胞为了实现其成熟的结构和透明的功能，经历了一系列的细胞重塑事件，包括细胞器完全消失和晶状体无细胞器区(OFZ)的形成[30]。Brennan等[31]在人和鸡胚的自噬溶酶体中检测到线粒体的存在，并且发现BNIP3L蛋白表达在OFZ形成过程中达到峰值。并且进一步研究发现，小鼠晶状体纤维分化区域的BNIP3L蛋白表达较高；然而，BNIP3L-/-小鼠在晶状体的相同区域保留了线粒体[31]。如果在纤维细胞分化过程中，晶状体中功能失调的线粒体成分和其他自噬相关的小泡没有被清除，它们就会在OFZ积聚，最终导致白内障，这是视力丧失的主要原因之一。

2.2.2 PINK1/Parkin信号通路在ARC中的作用氧化应激诱导的LEC线粒体去极化/损伤会导致ROS水平的增加和细胞死亡，氧化和破坏晶状体的稳定和白内障的形成。研究表明，在氧化应激条件下，Parkin可转运到去极化的LEC线粒体膜上，招募p62清除损伤的线粒体。另外，研究发现Parkin消除受损的LEC线粒体会降低ROS水平，并且对氧化应激暴露后LEC的稳态和存活至关重要[32]。因此，线粒体自噬参与了晶状体细胞器的降解，为白内障的病理机制提供了新的见解。

2.3 青光眼

2.3.1 PINK1/Parkin信号通路在青光眼中的作用青光眼是由视网膜神经节细胞(RGCs)的进行性损伤引起的，会导致严重的、不可逆的失明，预计到2040年将有1.118亿人受到青光眼的影响[33]。原发性青光眼的发生发展被公认为具有显著的年龄相关性，年龄是原发性青光眼发生的独立危险因素，50岁以上人群原发性青光眼患病率显著增加[34]。

谷氨酸兴奋性毒性是青光眼性神经退行性变的一种病理生理机制，可导致线粒体动力学改变，导致线粒体功能障碍和细胞死亡[35]。过表达Parkin可保护RGCs免受谷氨酸兴奋性毒性损伤[36]。此外，在慢性高血压青光眼大鼠模型中，过表达Parkin后LC3-Ⅱ/Ⅰ和溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的水平随眼压的升高而增加，线粒体自噬激活，RGCs死亡率降低。此外，研究发现高眼压大鼠线粒体自噬相关Parkin基因表达增加，这为线粒体自噬参与青光眼性RGCs损伤提供了新证据[37]。Hu等[38]通过慢性高眼压性青光眼模型发现，过表达视神经萎缩蛋白1(OPA1)和Parkin导致RGCs死亡减少，这表明清除受损的线粒体具有RGCs保护作用。OPTN不仅与POAG有关，而且具有泛素和LC3的结合域，是Parkin依赖性线粒体自噬通路的受体。但Chernyshova等[39]利用自噬受损的HeLa细胞研究发现，青光眼突变OPTN蛋白保持了其线粒体自噬受体的正常特性，提示青光眼OPTN基因突变可能与线粒体自噬无关。总之，虽然有证据表明自噬不平衡损害了RGCs的存活率，但其精确机制需要进一步的研究。

2.3.2 BNIP3/BNIP3L信号通路在青光眼中的作用线粒体解偶联蛋白2(UCP2)被发现在多种神经退行性疾病动物模型中减轻氧化应激和神经损伤[40]。Hass等[41]在UCP2敲除的小鼠前房注射微珠建立高眼压模型，他们发现，RGCs特异性的UCP2缺失减少了ROS介导的蛋白修饰数量和RGCs死亡。UCP2的缺失促进了线粒体自噬，在受损的线粒体对细胞产生损害之前清除线粒体，并为RGCs提供保护。通过测量LC3B和线粒体特异蛋白(TOM20)的共定位、线粒体表面积以及BNIP3L蛋白的表达，可以定量观察线粒体自噬水平。UCP2的发现可能为青光眼线粒体自噬提供了新的治疗靶点，以预防高眼压下的RGCs死亡。

2.4 AMDAMD是一种复杂的视网膜疾病，是导致老年人失明的主要原因，由环境和遗传风险因素共同导致[42]。在AMD中，视网膜色素上皮(RPE)细胞表现出IMM和OMM结构的严重破坏，线粒体大小的改变和动态细胞质组织的变化。氧化应激的增加和RPE细胞损伤在AMD的进展中起着关键的作用[43]。

Lee等[44]发现，RPE 细胞受到病理刺激后，PINK1积聚在线粒体膜表面启动线粒体自噬，预防RPE细胞进一步受损。Sridevi等[45]用核因子红细胞-2相关因子2和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α双敲除(NFE2L2/PGC-1α-/-)的小鼠建立干性AMD小鼠模型，该模型具有线粒体功能障碍和氧化应激等特征。Nrf2主要参与氧化应激调节，而PGC-1α参与线粒体生物发生和抗氧化防御系统。研究团队对这种模型小鼠的RPE细胞进行共聚焦显微镜观察发现，线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的共定位增加，而溶酶体标记物LAMP2和ATP合酶表达并未明显改变。此外，Stenirri等[46]的一项研究显示，线粒体铁蛋白(FtMt)突变与AMD密切相关，该研究涉及50例不同疾病阶段的AMD患者，包括渗出性、非渗出性和早期AMD患者。FtMt是一种含铁的抗氧化蛋白，研究表明，铁螯合通过PINK1/Parkin信号通路减少胞质铁诱导自噬[47]。RPE中FtMt的增加可能通过触发线粒体自噬而起到保护作用，但由于血管内皮生长因子分泌增加而诱导新生血管形成，从而导致湿性AMD。然而，低氧状态下RPE细胞中功能性FtMt水平的降低可能导致年龄相关应激引起的干性AMD[48]，这为AMD提供了另一种潜在的治疗策略。此外，在一个钙细胞毒性的果蝇模型中，活性瞬时受体电位TRPP3365通道导致视网膜退化，在光感受器中发现线粒体形态和功能异常，过表达PINK1和Parkin能阻止瞬时受体电位TRPP3365诱导的光感受器细胞变性[49]。总之，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬障碍是导致AMD的重要原因，通过线粒体自噬增加受损线粒体的清除率可增加RPE细胞活力，靶向线粒体自噬相关蛋白(如FtMt)可能是预防AMD进展的治疗方法。

2.5 DRDR是糖尿病患者常见的微血管并发症，是导致24至64岁人群视力损害和失明的主要原因,其最重要的病理特征是血-视网膜屏障缺损。其中，RPE和Müller细胞在维持血-视网膜屏障的完整性中发挥关键作用[50]。目前研究者在糖尿病体内外模型中发现，糖尿病可导致RPE和Müller细胞中线粒体自噬减少，并导致其死亡。

Devi等[51]观察到高糖培养的ARPE-19细胞可发生线粒体功能障碍，线粒体受损率增加，线粒体自噬通量减少。Zhang等[52]通过高糖刺激RPE细胞发现ROS产生增加，细胞自噬减少，细胞凋亡增加。同时证明高糖状态下的线粒体自噬减少是通过ROS的积累抑制PINK1和Parkin基因的表达。过表达PINK1基因可减轻高血糖对RPE细胞的毒性作用。这说明在高血糖环境中，DR患者ROS升高、线粒体自噬减少和细胞死亡增加之间存在密切关系，并且促进线粒体自噬可能是延缓DR发展的有效靶点。

db/db小鼠是目前研究DR较为成熟的动物模型，具有RGCs、内皮细胞和周细胞凋亡增加，基底膜增厚，视网膜胶质细胞激活等特点[53]。三七皂苷R1(NGR1)是一种具有抗炎特性和清除ROS的中药。Zhou等[54]通过对db/db小鼠玻璃体内注射NGR1后发现，PINK1和Parkin表达增强、LC3II/I比值增加、透射电子显微镜下可见自噬体增加以及GFP-LC3同线粒体标记物共定位增加。而沉默PINK1表达逆转了LC3II/I的比值，减轻了DR的进展。这项研究支持了抗氧化治疗通过靶向PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在预防DR中的作用[53]。

3 总结

线粒体是细胞能量的发生器，其正常运转可维持细胞活力。线粒体自噬作为清除和修复损伤线粒体的过程，在线粒体功能调节和损伤后修复中起重要作用。许多研究表明，年龄相关性眼病中存在线粒体自噬通量的降低，适当的线粒体自噬有助于保护视网膜相关细胞，而线粒体自噬不足或过度是有害的，会导致细胞死亡，加重年龄相关性眼病的发展。进一步研究线粒体能量代谢和自噬与衰老之间的调控机制，针对线粒体自噬相关的小分子或蛋白质干预可能为治疗年龄相关性眼病提供新的靶点。