细胞焦亡在肝病中的作用及中医药治疗的研究进展*

于金洋，符佳美，谢晶日

1 黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2 黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040

细胞死亡是生物学中普遍存在的现象，细胞焦亡作为一种细胞程序性死亡的新形式，在免疫防御机制中具有重要的影响。近期研究表明，细胞焦亡是肝脏疾病的发生、发展的重要环节。肝脏疾病发病因素多样，造成人体不可逆损害，严重影响患者的生存质量。为进一步探讨肝脏疾病的发病机制，明确细胞焦亡与肝脏疾病发生、发展的关系，通过总结国内外最新文献论述，对细胞焦亡的发生机制、细胞焦亡在肝病中的作用及中医药的治疗进展作一阐述。

1 细胞焦亡的发生机制

细胞焦亡是动物生长、组织维持平衡及衰老过程中的一个环节[1]，其发生的过程是一种由炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）诱导的坏死性和炎症性、程序性细胞死亡的过程[2]，是机体抵御外界病原体的天然免疫反应；但细胞焦亡过度发生可能引起炎症反应及免疫系统疾病。细胞焦亡的发生机制可分为4 个阶段：①“危险信号”的识别；②炎症小体活化；③caspase-1 蛋白的激活；④最终导致细胞焦亡的触发。宿主生物具有模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs），天然免疫系统可以识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），来激发宿主的防御机制，模式识别受体是识别信号的关键，最先接触病原体。经典的细胞焦亡途径与炎症小体密切相关，是依赖caspase-1 的细胞焦亡途径[3]。受体PRRs 通过识别PAMPs 和DAMPs，来激活炎症小体。以无活性形式存在的pro caspase-1 被CARD 结构域（caspase recruitment domain，CARD）和热蛋白结构域（pyrin domain，PYD）募集水解成为具有活性的caspase-1。而成熟的caspase-1 是切割白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的关键，当细胞内源危险信号或病原体被细胞质中的受体所识别，引发受体的活化与寡聚[4，5]。具有活性的caspase-1 将IL-1β 前体和IL-18（interleukin-18，IL-18）前体变为有活性的IL-1β 和IL-18，并切割gasdermin-D（gasdermin-D，GSDMD），其N 端在细胞膜上成孔，导致细胞肿胀破裂，炎症因子大量释放到胞外，从而引发细胞的焦亡[6，7]。非经典的细胞焦亡途径则是依赖caspase-4、caspase-5、caspase-11 介导的（其中人类为caspase-4、caspase-5，鼠类为caspase-11）[8]，这些蛋白能够直接识别革兰阴性菌的内毒素壁脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），焦亡是它们激活后的主要反应。与Caspase-1 激活发生在巨噬细胞或树突状细胞中，不同的是，caspase-4、caspase-5、caspase-11 发生在巨噬细胞和非巨噬细胞[9]，在TLR3/TLR4-TRIF（Toll-like receptor 3，TLR3；Toll-like receptor 4，TLR4；TIRdomain-containing adaptor-inducing interferon-β，TRIF）的作用下，可直接诱导IL-1β 和IL-18 成熟与释放，从而使细胞焦亡现象发生。当caspase-11 的CARD 结构域与LPS 结合时，加速了自身寡聚与活化，从而产生蛋白酶活性，切割GSDMD 使其N 端在细胞膜上快速形成直径为10～15 nm 的膜孔，进而诱导细胞焦亡的发生[10]。简而言之，细胞焦亡能够产生IL-1β 与IL-18，是人体产生急性和慢性炎症的主要原因，其属于内源性致热源，也是发热的主要因素[11，12]。

2 细胞焦亡在肝脏疾病中的作用

肝脏疾病发病率的增高，已是我国长期以来严重威胁健康的重要问题，部分因各种原因导致肝病的患者逐渐发展为肝硬化以及肝癌[13]。近期研究报告表明，细胞焦亡可能在肝脏疾病的发生、发展中起到关键作用。肝脏炎症、感染性肝纤维化，以及肝细胞癌已被证实与肝硬化进展过程中的细胞焦亡有关[14]。

2.1 细胞焦亡与病毒性肝炎

肝炎作为常见消化系统疾病，包括病毒性肝炎和自身免疫性肝炎。病毒性肝炎是指肝细胞受病毒感染而引起的肝脏炎症，具有较高死亡率。以乙型病毒性肝炎（hepatitis B virus，HBV）和丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV）为主，可发展为肝纤维化，甚者导致肝硬化、肝癌。细菌内毒素可以高度诱导肝细胞内的细胞焦亡，这也可能触发细胞焦亡而影响肝病的进展[15]。已有文献证明，在病毒性肝炎中，乙型、丙型肝炎的发生、发展与细胞焦亡相关[16]。病毒DNA/RNA 和模式PRRs 的识别诱导炎性小体激活并导致细胞焦亡。转移受体的TM 结构域可能通过阻断多种病毒感染过程中依赖AIM2 的信号转导通路、而降低包括裂解的caspase-1 和IL-1β 在内的细胞焦亡标志物的表达。乙型肝炎病毒通过抑制NF-κB（nuclear transcriptional factor Kappa B，NFκB）分子信号通路和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的合成，从而抑制脂多糖诱导的NLRP3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）和IL-1β 的表达。研究表明，乙型肝炎核心抗原（hepatitis b core antigen，HBcAg）能诱导包括IL-18 在内的另一种嗜热性细胞焦亡指标的分泌，这意味着HBcAg 的侵袭是HBV 介导的细胞焦亡的主要诱发因素之一[17，18]。在过氧化氢刺激条件下，NLRP3 炎症体被高水平的mitoROS 激活，并介导乙型肝炎病毒x 蛋白（hepatitis b virus x protein，HBx）诱导的肝脏炎症和肝细胞焦亡[19]。丙型肝炎病毒可通过caspase-1 和caspase-3 信号介导诱导细胞焦亡。而在在肝脏细胞中，脂质滴的形成与NLRP3 密切相关，导致HCV 的形态变化与复制，在肝病的发展中起到促进作用[20]。根据相关研究，在慢性HCV 中，Kupffer 细胞产生的IL-1β 与炎症反应相关，已被证实为IL-1β 的主要来源[21]。因此，为明确病毒性肝炎的发生、发展机制应深入研究细胞焦亡与乙型、丙型病毒性肝炎的关系，从而为疾病的治疗提供方向。

2.2 细胞焦亡与酒精性肝病

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由过量饮酒引起的肝脏损伤和炎症，是死亡率较高的疾病，也是导致肝纤维化和肝硬化的重要因素，其特征是肝细胞脂质沉积异常和氧化应激过度。虽然多项研究已经发现了几种典型的酒精诱导的肝细胞损伤途径，包括内质网应激、氧化应激、细胞焦亡、凋亡和自噬；但这些机制如何导致病情恶化仍有待验证。研究指出，RNA 测序分析显示，实验中ALD 患者和小鼠肝脏组织中caspase-4 和caspase-11 基因的表达水平升高[22]。NLRP3 寡聚抑制剂MCC950 能显著提高细胞活力，保护肝细胞免受乙醇诱导的细胞焦亡，这充分表明，NLRP3 炎性小体的激活在ALD 的发生、发展中起着重要作用。据报道，NLRP3可以募集凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和Pro caspase-1，使之成为成熟的caspase-1，从而引发肝损伤。NLRP3 的炎性小体激活与ROS 密切相关，而主要来源是线粒体。许多研究证实，线粒体相关的能量代谢、信号转导和ROS 的产生，是细胞程序性死亡的关键[23]。在酒精作用下，肝细胞中的miRNA-148a 的表达降低，还可使硫氧蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）过度表达，而TXNIP 的过度表达可活化NLRP3 炎症小体，从而发生以caspase-1 介导的细胞焦亡。上述表明，NLRP3 炎症小体在酒精性肝病的发生、发展中起着关键作用，而NLRP3 的激活机制尚不完全明确，后续可以此为切入点深入研究。

2.3 细胞焦亡与非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是在没有大量酒精摄入的情况下发生弥漫性的肝细胞脂肪变性，通常与肥胖、糖尿病和代谢综合征有关。疾病范围从伴有或不伴有炎症的轻度脂肪变性、到脂肪变性引起炎症和肝细胞损伤，甚至发生纤维化和肝硬化。非酒精性脂肪性炎症（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）不仅是NAFLD 的重要病理阶段，也是NAFLD 治疗的关键时期。有实验用HepG2 细胞（oleic acid（OA）-treated human hepatoma cells，HepG2）制备NASH 模型，在模型组中，NLRP3、GSDMD 和IL-1β 的表达明显增加，说明NLRP3 炎症小体是NASH 形成的因素。NAFLD 发生的刺激因素还与胰岛素抵抗有关，NLRP3 可激活炎症因子IL-1β、IL-18 以及NF-κB，而这些炎症因子和相关蛋白与胰岛素抵抗密切相关，促进了NAFLD 的发生、发展[24]，引起肝细胞的氧化应激反应，ROS可以触发TXNIP 从TRX 解离并与NLRP3 结合，导致NLRP3 激活，且TXNIP 表达的上调使IL-1β、IL-18 过度表达，加重炎症程度[25]。故NLRP3 小体的活化是细胞焦亡的关键所在，而细胞焦亡导致NAFLD 与NASH 的发生。

2.4 细胞焦亡与肝纤维化

肝纤维化是肝组织中细胞外基质的过多沉积，导致肝脏结构和功能的改变。这些变化的基础是由慢性肝损伤引起的纤维生成和纤维溶解之间的不平衡。小鼠和人的肝细胞可以在NLRP3 炎性小体激活后发生焦亡，随后释放NLRP3 炎症小体，从而促进和维持炎症小体驱动的纤维化形成。抑制caspase-1 和GSDMD 的激活可抑制细胞焦亡的发生。研究表明，敲除GSDMD 的人肝细胞癌HepG2 细胞或GSDMD 敲除小鼠原代肝细胞，两者对炎性小体诱导的细胞焦亡具有抵抗力，表明肝细胞的死亡依赖于GSDMD 的激活。研究还指出，肝细胞NLRP3 过度激活导致肝细胞焦亡和炎症小体分泌到胞外间隙。在NASH 患者肝组织中，存在Caspase-1 活性，其血清中caspase-1 活性与肝损伤程度、尤其是与肝纤维化程度有关。活化的Caspase-1、IL-1β 和IL-18 能够活化NLRP3，而IL-1β 和IL-18 诱导胶原蛋白沉积，对于形成肝纤维化十分重要[26]。细胞焦亡与肝纤维化密切相关，应继续根据NLRP3 炎症小体引起肝纤维化的机制作深入研究，以便于更好地控制该病的发生与发展。

2.5 细胞焦亡与肝细胞癌

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在肝病中较为常见，在消化道恶性肿瘤中属于极具侵略性的原发肿瘤，寻找新的治疗靶点成为HCC 治疗的迫切需求。炎性小体作为细胞内多蛋白复合体，能够介导宿主对病原体感染和细胞损伤的免疫反应。在肿瘤微环境中，慢性炎症，在肿瘤发展过程中起着关键作用。炎症小体在不同类型的癌症中具有“双刃剑”作用，既是肿瘤的促进者，也是肿瘤的抑制者。NLRP3 炎症小体的成分在肝癌细胞中显著下调，肝癌组织和细胞中的细胞焦亡受到抑制，这表明依赖NLRP3 的细胞焦亡可能在肝癌中起关键作用[27]。长链非编码RNA（lncRNAs）作为新型调节因子，是肿瘤发生、发展过程中的关键，包括细胞焦亡、增殖、凋亡和细胞周期进展。相关研究表明，肝癌组织和细胞系中SNHG7 和SIRT1（small nucleolar RNA hostgene 7，SNHG7；sirtuin1，SIRT1）基因表达上调，miR-34a 基因表达下调。SNHG7 能够抑制miR-34a，同时上调SIRT1 的表达，从而抑制NLRP3 诱导的细胞焦亡。这些研究结果表明，SNHG7/miR-34a/SIRT1 轴可能是治疗肝癌的潜在靶点[28]。另外，IRAK1（interleukin-1 receptor-associated kinases 1，IRAK1）是TLR 介导的信号通路中的关键分子。TLR 分子的激活可以诱导MyD88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）的合成，从而导致IRAK1 及其下游信号通路的激活而诱导细胞焦亡。IL-1 受体相关激酶包括一类丝氨酸苏氨酸激酶（如IRAK1、IRAK2、IRAK3 和IRAK4）。研究证实，IRAKs 与代谢、炎症和恶性疾病的病理生理过程有关。IRAK1 在肝癌进展中的生物学功能及其调控机制，其下调可以抑制NLRP3 炎性小体的激活，阻止肝癌细胞的侵袭、增殖及迁移，促进肝癌细胞的凋亡。实验显示，IRAK1 基因的敲除可以抑制ERK/JNK-NLRP3（extracellular signal regulated kinase，ERK；c -Jun N -terminal kinases，JNK）炎性小体的激活，从而阻止肝癌的恶性进展。IRAK1 在肝癌中的分子机制与NLRP3 信号的介导有关，提示IRAK1是治疗肝癌的潜在靶点。研究者发现，IRAK1 的敲除可以显著下调IL-1β、NLRP3、p-ERK1/2、p-JNK1/2 的表达，并推测IRAK1 对肝癌的促进作用可能与MAPKs/NLRP3/IL-1β（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路有关[29]。靶向调控NLRP3 炎症小体，可能达到控制阻止肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这可能为治疗该病提供新的方向。

3 中医药调控细胞焦亡

中医《素问·灵兰秘典论》记载：“肝者，将军之官，谋虑出焉”，将肝的功能比作将军，论述其统帅脏腑气机运行，贮藏血液助君脏行血，为“将军之官”的核心体现。肝易受到情志及外感、内伤等因素的影响，从而形成多种疾病，如中医古籍中提到的“胁痛”“黄疸”“鼓胀”等，中医常以疏肝、健脾、解毒、化瘀、利胆、退黄等方法辩证施治。随着中医药的现代化进展，许多中药复方、中医经典方剂以及中药单体可以通过调控细胞焦亡发挥治疗肝脏疾病的作用。

3.1 中药复方

吴佳蔓等[30]认为，痰、瘀、毒互结是高脂血症肝脏脂代谢紊乱的重要因素，既是主要病机也是病理产物。运用清热解毒法可显著降低实验组SD 大鼠的血脂水平，对细胞焦亡炎症小体NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-1β 的蛋白水平和mRNA水平有显著下调作用，能够下调炎症因子水平，改善肝组织细胞。唐标、尹抗抗等[31，32]对降脂理肝汤（泽泻10 g，决明子30 g，郁金10 g，丹参10 g，荷叶10 g，海藻30 g）干预高脂饮食诱导的NAFLD 作用机制进行研究，模型组大鼠肝组织GSDMD、GSDMD-N、Caspase-11 的蛋白表达水平升高，血清TNF-α、IL-18、IL-1β、IL-6 的表达水平升高。经降脂理肝汤干预后，各项指标表达水平均显著降低，表明降脂理肝汤可抑制非经典细胞焦亡，对在高脂饮食诱导下的NAFLD 有干预作用。岳紫晨等[33]通过实验研究证实，健脾理气方（黄芪30 g、白术10 g、白芍15 g、薏苡仁15 g、神曲10 g、云苓15 g、郁金10 g、法半夏10 g、柴胡6 g）通过下调NLRP3 炎症小体、防治D-GalN（D-galactosamine，D-GalN）诱导的大鼠内毒素性急性肝损伤。周青丽等[34]经实验得出结论，在NAFL 进展为NASH 的过程中，NLRP3 炎症小体表达升高。在NASH 模型大鼠中，去脂软肝方（三七、白芍、莪术、山楂等7 味中药）可降低NLRP3 炎症小体的表达，减轻脂肪变性及炎症病变。

3.2 中药经方

穆杰等[35]结合网络药理学研究四逆散调控炎症小体对NAFLD 的治疗作用，提示四逆散能够作用于NLRP3 炎症小体及其相关炎症因子，模型组肝组织中NF-κB、ASC、NLRP3、Caspase-1 的蛋白含量及mRNA 水平升高，肝组织与血清中TNF-α、IL-1、IL-1β 含量升高。患者经四逆散治疗后，NF-κB、ASC、NLRP3、Caspase-1 的蛋白含量及mRNA 水平明显下降，血清中TNF-α、IL-1、IL-1β 含量降低。上述结果表明，在慢性心理应激相关的NAFLD 中，应用四逆散对其细胞焦亡引起的炎症反应有显著改善。邓楠等[36]实验也证实，四逆散调控细胞焦亡相关通路NLRP3/IL-1β 治疗NAFLD。杨莹等[37]为验证五苓散在代谢综合征小鼠肝肾炎症中的保护作用，进行动物实验并得出结论，五苓散可以下调动物模型肝脏SREBP-1c（sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c）、FAS（fatty acid synthase，FAS）、SCD1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）蛋白表达，抑制NLRP3 炎症小体与NF-κB 通路的激活，从而改善模型组小鼠肝脏中的炎症状况，减轻了甘油三酯的堆积与炎症，证明五苓散对果糖诱导的肝脏炎症损伤可能发挥着预防与治疗作用。

3.3 中成药

郝媛媛等[38]研究表明，中药津力达降低甘油三酯与谷草转氨酶的含量，下调NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达水平，抑制P20、IL-1β 基因表达，通过抑制焦亡通路蛋白治疗NAFLD。汪溪等[39]在痤疮丙酸杆菌和脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤模型中，验证了扶正养肝合剂对急性肝损伤的缓解作用，抑制小鼠AST、ALT（aspartate aminotransferase，AST；alanine aminotransferase，ALT）水平，降低脂质过氧化指标MDA（malondialdehyde，MDA）含量，增加肝脏的抗氧化能力，从而对肝脏起到保护作用，其作用机制与扶正养肝合剂抑制急性肝损伤小鼠组织中的NLRP3 炎症小体激活有关。徐娇雅等[40]研究发现，降脂颗粒可以改善NASH 小鼠脂毒性肝损伤，其作用机制可能与降低UCP2（uncoupling protein 2，UCP2）表达与抑制JNK/c-Jun 信号通路的激活有关，从而使NLRP3 炎症小体的活化受到抑制。周桃梅等[41]通过临床观察对外周血进行检测，观察组患者NLRP3、IL-1β、IL-18 与对照组相比明显降低，提示强肝胶囊联合二甲双胍对NAFLD 患者的胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱以及肝损害有改善作用，可能与抑制NLRP3 和下游炎症因子相关。段桂娇等[42]通过随机对照实验得出结论，柔肝化纤颗粒联合恩替卡韦治疗肝肾阴虚型的代偿期乙肝肝硬化收效显著，可下调Caspase-1、IL-1β、IL-18及TNFα（tumor necrosis factor-alpha，TNFα）的表达水平。

3.4 中药单体

黄芩苷（baicalin，BA）可降低NLRP3 和GSDMD 表达水平，减少IL-1β 和IL-18 的释放，从而减轻细胞焦亡。此外，GSDMD 基因敲除还可减弱BA 的改善作用。在体外BA 可通过阻断NLRP3/GSDMD 信号通路减轻肝细胞焦亡，从而减轻非酒精性脂肪性肝炎细胞模型的损伤程度[43]。环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是治疗癌症常用药，其应用较为广泛，弊端是引起急性肝毒性。川芎嗪对CP 及其活性代谢物4-羟基环磷酰胺所致的肝损伤具有保护作用，通过对TXNIP/Trx/NF-κB 通路的抑制作用，从而显著减轻肝损伤，抑制炎症反应与氧化应激，改善肝脏结构与功能[44]。柴胡皂苷d 对人肝细胞损伤具有保护作用，能够抗肝纤维化，抑制肝L02 细胞氧化应激损伤、提高细胞活力，抑制肝L02 细胞焦亡，控制上皮间质转化过程，从而达到抗肝纤维化的作用[45]。莪术醇可以抑制NLRP3 炎症小体，降低Caspase-1 与IL-1β 表达，从而降低肝脏炎症反应，这可能与其抗肝纤维化机制有关[46]。槲皮黄酮可以抑制LPS 诱导的肝L02 细胞炎症反应，下调炎症小体NLRP3、IL-1β、Caspase-1 与TNF-α 的表达，能够促进肝细胞增殖，改善肝细胞损伤[47]。人参皂苷能改善高脂饮食模型小鼠的NAFLD，可抑制NLRP3、IL-1β 来减轻肝脏炎症，提高氧化酶活性，改善脂质过氧化，减轻肝脏损伤[48]。

在现有研究中，已证实细胞焦亡与肝脏疾病存在相关性，细胞焦亡在肝病领域的研究尚处于基础阶段。中药复方、中医经典方剂以及中药单体对于治疗肝脏疾病疗效显著，通过干预细胞焦亡来治疗肝脏疾病的研究逐步深入，其仍具有较大发展空间。

4 总结

作为细胞死亡的一种新形式，细胞焦亡在维持新陈代谢和免疫平衡方面起着重要作用。细胞焦亡作为近年来的研究的热点，为肝病的治疗提供新方案，受到国内外研究人员和临床医生的关注。NLRP3 炎性小体的激活是细胞焦亡过程的重要调节因子，在包括HBV、HCV、NAFLD、HCC 和纤维化等肝病的发生发展中起着不同的作用。基于细胞焦亡的中医治疗肝脏疾病的研究处于基础阶段，仍需深入研究，目前较多的是探讨细胞焦亡对非酒精性脂肪性肝病的影响，而其他类型肝脏疾病涉及较少。在以往的研究中，GSDMD 在肝细胞中的表达水平较低，但在胃肠道疾病研究中显示有较高的表达水平，提示在将来的科研工作中应着重采用回复实验、正向验证与反向验证相结合等方法，明确其在肝病发病机制中的作用。近年来，中医药治疗肝脏疾病疗效得到认可，应积极开展对于细胞焦亡在中医药治疗肝脏疾病中的作用机制研究。对于细胞焦亡与肝病发病机制的探讨已为预防和治疗肝脏疾病提供了有意义的策略，而细胞焦亡的相关研究仍需努力拓展，进一步明确肝脏疾病的发生机制，为中西医治疗肝病提供新思路。