终板软骨细胞衰老在腰椎间盘退变中的研究进展

张艳琳 黄国付 邹 璟 汪 敏 王昆秀

腰椎间盘退变(lumbar intervertebral disc degeneration, LIDD) 是多种脊柱疾病的主要原因，临床常诱发下腰痛、肢体麻木等症状，其病理特征主要包括纤维环撕裂、软骨终板结构改变和椎间盘塌陷[1]。其中软骨终板不仅是椎间盘结构稳定的基础，还是椎间盘进行物质交换和营养供应的重要通路，而终板软骨细胞(endplate chondrocytes, EPCs)是终板软骨组织内唯一细胞类型，负责分泌各种细胞外基质(extracellular matrix, ECM)以维持椎间盘正常生理功能。研究表明，EPCs衰老会导致ECM分泌减少和代谢失衡，促进软骨终板钙化损伤，最终加速椎间盘退变，提示EPCs衰老可能是LIDD发生、发展的重要机制[2]。

一、EPCs及其衰老概述

软骨终板是位于椎体和椎间盘之间的薄层透明软骨，承担整个椎体的压缩载荷，并通过弥散机制为椎间盘供给营养，当软骨终板区域受损，相邻椎间盘的营养交换能力会明显下降。生理条件下，EPCs多成群分布于软骨陷窝内，电镜下观察其表面有突起和皱褶，胞质内有大量的粗面内质网、发达的高尔基复合体以及少量线粒体[3]。正常情况下，EPCs负责合成以蛋白多糖(proteoglycan, PG)和Ⅱ型胶原为主的ECM，ECM参与组成髓核组织基质成分，并在各种合成和分解酶的作用下维持着代谢平衡。ECM中PG分子间孔径的大小可以影响椎间盘中电溶质的分布转运，胶原纤维与椎体上下面平行排列，又相互交叉形成具有通透性的弹力网，大量PG黏附其上，这种结构，使软骨终板既具有高频率的渗透交换功能，又具有抗皱缩和抗牵张能力[4]。细胞衰老作为一种应激反应，其最初目的是消除受损细胞并保持组织再生能力，然而随着年龄增长和各种机械应力、损伤等刺激，衰老-清除-再生的程序无法完整进行，从而导致组织机能下降。EPCs衰老时会进入不可逆的细胞周期停滞状态，此时细胞合成蛋白质能力减弱，ECM分泌减少，ECM代谢失衡及受压钙化，细胞自我修复能力降低，细胞增殖分化能力下降，继而造成软骨终板功能减弱和结构紊乱。

二、EPCs衰老机制

1.DNA损伤：真核细胞在分裂间期完成DNA分子复制和蛋白质合成，通常包括G1期、S期(DNA合成期)和G2期(蛋白质合成期)3期， 细胞衰老时细胞生长停滞于G1期而失去合成DNA和有丝分裂的能力。调控细胞周期的蛋白包括细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitor, CDKI)。CDK属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，目前已知其家族成员有13个(CDK1～13)，其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期，启动DNA复制和诱发有丝分裂[6]。cyclin可与CDK组成蛋白激酶复合物(cyclin-CDK复合物)。CDKI属于细胞周期的负调控因子，可分为Ink4家族和KIP家族，其中Ink4家族的p15、p16等通过与cyclin-CDK复合物结合，抑制CDK4/ CDK6激酶活性；KIP家族中的p21、p27等可单独与CDK结合，降低cyclin-CDK复合物的活性，抑制cyclin作用，从而阻碍细胞周期正常进行[7]。DNA损伤时，细胞为修复损伤首先启动损伤感应，通过上调p53、p21等抑制cyclin-CDK复合物的活性，使细胞周期停留在G1/S期，从而诱导细胞衰老。Hafsia等[8]研究发现，半乳糖凝集素3 (galectin-3, Gal-3)基因敲除小鼠的EPCs分解代谢、肥大标志物和凋亡因子水平均升高，而Gal-3抑制剂可以显著提高正常小鼠EPCs的凋亡率。在此基础上，刘岩路等[9]研究发现，Gal-3抑制剂可能通过抑制cyclin或CDK活性导致S期减少，G2期停滞，DNA合成受损，从而抑制EPCs增殖。由此可见，DNA损伤导致cyclin、CDK、CDKI等细胞周期相关蛋白表达异常，EPCs增殖分化能力降低，从而促进EPCs衰老。

2.端粒缩短：EPCs衰老的主要原因之一是端粒缩短和端粒酶的下调。端粒在防止染色体降解、融合或重组、维持染色体的稳定性和完整性以及确保遗传信息的完整复制方面发挥着重要作用[10]。Zhu等[11]研究发现，在细胞分裂或复制过程中，传统的DNA聚合酶无法复制线性分子的3′端，导致沿着细胞系分裂的染色体逐渐缩短，端粒磨损引起复制能力的丧失，线粒体功能障碍，继而发生细胞衰老，这种作用机制也是EPCs细胞衰老的产生机制之一。退行性变椎间盘会出现端粒缩短，当端粒缩短增加时，端粒酶延长端粒的频率也随之增加，从而实现端粒长度的稳态，例如黄晓东等[12]经PCR检测发现大龄鼠来源的EPCs端粒相对长度更短，同生理状况的衰老相一致。

3.氧化应激：氧化应激源于促氧化和抗氧化稳态失衡，当细胞达到氧化状态并延长时可能会出现衰老，衰老细胞中氧化蛋白质的积累和不溶性物质的形成大大降低了蛋白质水解功能，导致细胞蛋白质稳态的丧失[13]。黄晓东等[12]研究表明，衰老越明显的EPCs，总抗氧化能力越低，抵抗过氧化损伤的能力越差。生理情况下EPCs中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生与清除处于动态平衡，当细胞受到机械刺激、高氧、高糖及炎性细胞因子等刺激时ROS的产生增加，高水平ROS的产生会造成EPCs膜脂质、蛋白质的氧化损伤以及DNA损伤，是EPCs衰老的诱导因素之一[14]。黄晓东等[12]报道称氧化应激可以通过盘状结构域受体通路，产生单链DNA损伤信号，激活共济失调毛细血管扩张突变基因(ataxia telangiectasia mutant gene, ATM)激酶活性，促进受损DNA附近组蛋白磷酸化，上调p53/p21的活性，从而引发细胞衰老。由此可见，氧化应激损伤可以引起DNA损伤，从而诱发EPCs衰老。

4.SASP紊乱：EPCs衰老除了经历细胞周期生长停滞之外，还分泌大量炎性细胞因子和基质蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)，包括MMP-1、MMP-3和MMP-10等蛋白，以及其他细胞因子和生长因子，这一特征称为衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)，其中炎性细胞因子IL-6 和 IL-8可以促进慢性炎症、驱动衰老并增加与年龄相关病变的风险[15]。SASP可以对邻近EPCs和ECM产生分解代谢作用，导致软骨终板结构和功能的破坏。张树文等[16]在衰老EPCs中观察到MMP和PG水解酶水平升高。由此可见， EPCs细胞内存在不平衡的基质代谢稳态，即合成代谢减少和分解代谢增加，是EPCs衰老的原因之一。

5.自噬抑制：在EPCs衰老机制中，细胞自噬是不可或缺的一部分。细胞自噬通过双膜结合液泡隔离细胞质成分形成自噬体，自噬体膜的启动、延伸、成熟及其与溶酶体的融合由不同的自噬相关蛋白介导，自噬体的形成随自噬相关蛋白的整体下降而减少。研究表明，EPCs自噬与衰老密切相关，激活自噬可以相对延缓EPCs衰老，促进细胞增殖生化过程[17]。例如Liang等[18]研究发现，姜黄素可以通过诱导自噬来保护EPCs，增强自噬在一定程度上可以减轻EPCs退化，而具有自噬抑制性的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase /protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路参与抑制EPCs的活性，并诱导细胞衰老与凋亡。

三、EPCs衰老对LIDD的影响

不同程度的EPCs衰老引起EPCs功能异常，包括ECM合成分泌减少、胶原结构改变、终板基质渗透作用减弱等，久而久之软骨终板钙化出现裂隙，结构紊乱致使终板功能缺失。椎间盘属于无血运组织，其所需营养主要依赖终板途径，软骨终板功能受损造成营养通道阻塞，椎间盘的物质交换能力明显下降，髓核血供及营养减少，髓核内源性修复失败而发生变性，最终椎间盘功能减弱，导致LIDD的发生和进展。相关数据显示，退变的椎间盘内，由于EPCs密度迅速降低，PG和Ⅱ型胶原的分泌减少，使得椎间盘基质中渗透压下降和水分子损失，椎间盘抗压能力和机械性能降低，最终导致椎间盘退变加速[5]。因此，阐明EPCs衰老机制对揭示LIDD发生、发展机制至关重要，有助于寻求防治LIDD的有效干预措施。

四、通过抗EPCs衰老调控LIDD进程

1.调控细胞周期相关蛋白表达通路：不同的细胞周期相关蛋白形成不同的信号通路参与调控EPCs衰老和LIDD，通过激活或抑制相关通路可以调控LIDD进程，常见的信号通路包括p21、p53、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase, p38MAPK)和Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)等信号通路[19]。例如周年等[20]通过建立人体外EPCs衰老模型，发现过表达信息调节因子2同源蛋白1(sirt1)通过抑制p53/p21信号通路，来抑制白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)介导的EPCs衰老，从而减缓LIDD发展。张宇等[21]研究证实，羟基红花黄素A能够通过下调p53蛋白表达来抑制EPCs衰老，从而延缓LIDD进程。柳根哲等[22]研究表明，益气活血汤可通过调控p38MAPK信号通路，下调大鼠椎间盘退变终板软骨中相关mRNA与蛋白表达，抑制EPCs凋亡，从而延缓椎间盘退变。

2.激活端粒酶活性：端粒酶能够恢复丢失的端粒DNA以减缓端粒的不断缩短，从而保护自身遗传信息，通过调节端粒酶活性，可以保护EPCs免受端粒磨损，减缓EPCs衰老，进而调控LIDD进程。端粒酶活性主要由端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)表达水平的高低决定。周荣平等[23]将hTRT基因腺病毒载体导入椎间盘细胞内发现，hTRT基因能够通过抑制椎间盘组织和细胞中PG以及Ⅱ型胶原的减少，有效阻抑椎间盘EPCs衰老以及LIDD。基于端粒酶的抗衰老策略，主要包括化学端粒酶激活剂、端粒酶表达激活剂和端粒酶基因治疗，未来有望通过慢病毒载体等细胞疗法，调控端粒酶活性，减少端粒缩短，来实现延缓EPCs衰老、减轻LIDD的目的[24]。

3.抗氧化损伤：ROS可以参与激活多种信号通路，如核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、p38MAPK、p53等信号通路，通过上调ECM降解酶和促炎性细胞因子，下调ECM合成代谢的基因，影响MMP、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)和PG等多种蛋白表达，从而调节EPCs的自噬、衰老与凋亡[25]。例如Zhou等[26]研究表明，促氧化剂H2O2诱导的氧化应激激活了p53/p21 通路，导致EPCs衰老。并且Yang等[27]研究发现，H2O2和IL-1β均可以使EPCs中PG和Ⅱ型胶原蛋白的 mRNA 水平降低，而抗氧化剂谷胱甘肽可以有效防止这种有害作用。这表明谷胱甘肽等抗氧化剂可以通过减轻氧化应激损伤导致的EPCs衰老，保护椎间盘结构和功能正常，而成为治疗LIDD的一种可行性选择。

4.维持SASP稳态:参与组成SASP的信号通路蛋白有NF-κB、p38MAPK、IL-1β等，通过激活或抑制相关信号通路，可以调控SASP的分泌表达，消除炎性细胞因子对EPCs的损害，进而保护终板软骨，有望成为治疗LIDD的手段之一。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，它参与机体的炎性反应、免疫应答，能调节细胞凋亡、应激反应，控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活。Ngo等[28]研究发现，DNA损伤时上游p38MAPK通路通过激活NF-κB的转录活性，调节SASP的表达和分泌，促进IL-6、IL-8和TNF-α的表达。王刚良等[29]研究发现，石蒜碱能够通过阻断EPCs内IL-1β诱导的NF-κB信号通路，减少MMP-3和MMP-13的表达，来保护软骨终板，延缓LIDD。这表明通过减弱分解代谢信号可以纠正SASP失衡，促进EPCs的去分化和再分化，纠正ECM降解和合成代谢之间的紊乱，从而促进椎间盘修复与再生，延缓LIDD进展。

5.激活自噬:自噬对软骨终板和椎间盘的保护作用，与自噬参与调控EPCs代谢有关。研究表明，自噬激活可以增加EPCs中Ⅱ型胶原的分泌，抑制MMP-13分泌，从而发挥保护椎间盘的作用[30]。例如Yu等[31]研究发现，自噬相关基因微管相关蛋白1A/1B-轻链3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3, LC3)和自噬效应蛋白1(beclin-1)的表达随着终板软骨细胞活性的降低而显著降低，自噬活性可能与椎间盘的发育和退变有关。左睿等[32]在构建小鼠软骨终板退变的模型上，发现氯喹抑制自噬时软骨终板退变加重，而雷帕霉素激活自噬可以对EPCs起保护作用，其作用机制可能是通过激活核因子E2相关因子2和(或)胞质蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/the kelch-like ECH-associated protein 1,Nrf2/Keap-1)信号转导，促进抗氧化蛋白表达，清除活性氧，减少EPCs衰老并维持其分化潜能来实现的。因此，通过激活EPCs内自噬水平来抑制软骨终板退变可以为减轻椎间盘退变提供新的治疗方向。

五、展 望

综上所述，研究EPCs衰老机制对LIDD的预防和治疗具有重要价值。EPCs衰老主要与DNA损伤、端粒缩短、氧化应激、SASP紊乱和自噬抑制等有关，通过减轻DNA损伤、激活端粒酶活性、抗氧化损伤、维持SASP稳态、激活细胞自噬等途径可以减轻EPCs衰老，保护EPCs合成分泌蛋白功能，维持ECM合成分解代谢平衡，保护软骨终板生理结构和功能，保障椎间盘的结构支撑和营养供应，从而延缓LIDD进程。通过保护EPCs来保护椎间盘的方法，可以为将来更成熟的细胞移植技术提供理论支撑，也为临床上防治LIDD相关疾病提供了新的思路。只是目前大多数研究尚处于细胞模型和动物实验阶段，缺少人体实验及临床研究数据，尚不明确这些途径是否能够在促进EPCs增生的同时保护其功能正常。另外目前关EPCs衰老的研究方向也比较单一，例如涉及到相关通路抑制剂和激动剂的使用，多停留在单方向通路研究，而多通路抑制剂或激动剂联合使用是否能发挥更好的作用，如何锁定核心作用机制尚不明了，因此今后应在不断完善分子机制研究的基础上积极开展相关的临床应用研究，去探寻更完善的治疗靶点。