ELISA在兽医实验室检测的应用

黄 雨，宁璐璐

（西北农林科技大学动物医学院 712100）

夏商周时期甚至更早之前，人类就知道诊断并治疗疾病，最初主要依靠对表面现象的观察和简单经验的积累。现代医学诊断学是在物理、化学等基础学科以及微生物学发展的基础上逐渐形成的更为精细的诊断学，因为显微镜的方面而研制出细菌分离培养、血清学诊断法，提高了疾病诊断的科学性和准确性。近年来，细菌学、病毒学、血清学、免疫学等迅速发展，由此也创建了针对特定的生物学病原的实验室检查、诊断方法和技术，显著地提高了兽医临床诊断的准确性、科学性和应用价值。1971年，Engvall和Perlmann分别研发出了酶联免疫吸附试验，即ELISA，可用于检测体液中微量物质。ELISA是疾病诊断中的一种新方法，不仅可以检测特异性抗原，如病毒、细菌、寄生虫或者是血清中的激素水平，还可用于定量或定性地检测血清中的抗体水平，现已在多种疾病的临床诊断方面得到推广。目前使用结果显示，ELISA具有敏感性强、特异性高、简便快速且易于自动化操作等特点，不仅适用于临床疾病诊断，而且也适用于流行病学调查。ELISA可用于检测抗原或抗体，现已作为一种对疾病进行早期诊断的快速检测技术，对于有效诊治及防控动物疾病具有重要意义。

1 ELISA的基本原理与分类

杜敏等[1]介绍了实验室常规ELISA检测的基本原理、操作要领及注意事项。ELISA的基本原理是利用抗原-抗体特异性反应，把某种抗原（或抗体）吸附于固相载体表面，再用某种特定酶标记抗原或抗体，测定时将受检样品和酶标抗原或抗体根据不同的方法依次与包被在固相载体上的抗原或抗体进行反应，形成抗原抗体复合物，洗去多余物质，加入底物后，底物被固相载体上的酶催化成有色产物，根据有色产物的量来确定待检样品中抗原或抗体的有无及多少。由于酶催化效率很高，间接地放大了免疫反应效果，从而使这种检测方法具有很高的敏感度。经过多位研究人员的改进与优化，目前常用的ELISA有间接ELISA（常用于检测抗体）、夹心ELISA（常用于检测大分子抗原）、竞争ELISA（常用于检测小分子抗原）等。

2 ELISA在几种动物疾病检测中的应用

2.1 ELISA在犬细小病毒病检测的应用

犬细小病毒病（Canine Parvovirus Disease，CPVD）是犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）引起犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病，各种年龄段的犬均可感染，断乳前后的幼犬极为易感，临床特征以出血性肠炎和非化脓性心肌炎为主，具有较高的发病率和致死率，对犬类的健康造成了极大的危害，同时也给我国养犬业带来了重大的损失。因此，对隐性感染CPV的犬和发病犬进行早期快速诊断，对预防该病的流行具有重大意义。

目前可根据血液学检查结果和临床症状对感染犬进行初步诊断，运用血凝与血凝抑制试验、血清中和试验、免疫扩散试验、ELISA等可对CPVD进一步确诊。其中酶联免疫吸附试验因特异性强、敏感度高、易操作而广泛应用于犬细小病毒病的快速诊断。在国外已有商品化试剂盒，国内也有多位学者已研制出快速诊断试剂盒。CPV诊断的ELISA方法包括间接法、抗原竞争法、Dot-ELISA等。由姜骞[2]等研制的犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒，是将大肠杆菌原核表达系统获得的CPV-2 VP2蛋白经亲和层析柱纯化后，以此为包被抗原创建的检测CPV抗体的间接ELISA法，试验结果表明该方法具有良好的重复性，准确性以及特异性。除此之外，刘剑郁[3]等研发的间接ELISA法是用犬肾细胞增殖犬细小病毒，纯化后作为包被抗原;国内也有学者建立了Dot-ELISA法诊断CPV，并发现其敏感性比常规ELISA更高。由此可见，ELISA技术现已成为一种广为应用的快速诊断CPV的方法。

2.2 ELISA在猫免疫缺陷病诊断的应用

猫免疫缺陷病（FID）又被称为猫艾滋病，是由猫免疫缺陷病毒（FIV）引起猫的慢性接触性传染病，该病毒导致机体免疫力下降，病猫常表现出发热、口炎、腹泻以及神经症状等，并伴有各种继发性寄生虫疾病[4]。尽管FIV致死率极高，但是对感染的猫进行恰当的治疗可延长病猫的生命，因此猫免疫缺陷病的早期确诊具有十分重要的意义。

FIV具有很长的潜伏期，猫感染后出现的临床症状大多是由于机体免疫系统被破坏，其他病原趁机袭入机体导致继发性感染的结果，所以其他一些与猫有关的疾病的临床症状在感染FIV的猫上均有所体现，因此仅凭临床症状的观察无法进行FIV的准确诊断。据报道，目前该病的确诊主要依靠病毒分离和抗体检测。病毒分离培养法是确诊该病的最佳方法，但因其检测周期长而不常用;ELISA技术由于具有较强的特异性、较高的敏感性、操作简便、快速、成本低、易于大量检测，是目前应用较多的一种检测方法，主要通过全血、血清或血浆等样本检测病毒p15和p24蛋白的特异性抗体。潘美乔[5]运用ELISA和PCR两种方法共同检测了在哈尔滨和上海市收集到的274只流浪猫感染FIV情况，结果显示11只为阳性，阳性总检出率为4%。赵莎莎[6]采用免疫荧光试验和ELISA检测感染猫血清中抗体，研究表明采用ELISA检出抗体比免疫荧光试验更早，而且滴度高，但也会存在假阴性的情况。Natasa[7]等通过酶联免疫吸附测定和聚合酶链反应对42只家猫进行FIV感染患病率调查。通过ELISA试验检查的42只猫中，FIV抗体血清反应阳性的有14只（33.3%），在PCR分析中，FIV阳性的有11只（26.2%）。FIV阳性猫的平均年龄为6岁，其中室外猫(65%FIV)和雄猫(71.4%FIV)的感染率较高。这项研究中使用的两种测试的结果均表明，斯洛文尼亚的猫中感染的患病率均很高，并且发现ELISA方法可用作快速检测FIV感染的筛选测试。

2.3 ELISA在犬心丝虫病诊断的应用

犬心丝虫又名犬恶丝虫，寄生于犬等其他动物的右心室及肺动脉内（少见于胸腔、支气管），其成虫寄生于心脏内，引起循环障碍，呼吸困难及贫血等症状，最终致死。心丝虫是动物心血管系统中最常见的寄生虫之一，除犬以外，猫及其他野生动物也易感[8]，美国、日本均出现过相关报道，在我国也分布甚广，北至沈阳，南至广州均有发现。叶青华和陈涛[9]首次在国内使用商品化犬心丝虫快速检测试剂盒(ELISA法)，同时也采用了改良Knott’s法对四川省境内的128只工作犬(包括警犬和护卫犬)进行了感染率调查，其感染率分别为20.31%和5.47%，结果表明ELISA法检测效果明显优于改良Knott’s法，同时也证明四川盆地是犬心丝虫病的流行区域。

甄森萍[10]等介绍了目前常用的犬心丝虫病的检查方法，包括直接检查、血涂片检查法、淡黄层检查法、改良Knott's技术、过滤技术、酶联免疫吸附法等10余种实验室检查方法，并表明酶联免疫吸附法的更具有优势。姜鑫[11]等建立了基于重组MTFP基因蛋白的犬心丝虫抗体Dot—ELISA检测方法，结果表明该方法敏感性高、重复性好、特异性强，并且可直接观察结果，易于在基层检疫工作中推广，为犬心丝虫病的临床诊断提供了一种切实可行的新方法。

3 总结

动物疾病临床诊断常用的细菌培养、细胞培养等微生物检查方法特异性虽强，但费时费力，检测成本高且不易推广;聚合酶链式反应受影响因素很多，结果不稳定，精确度低;免疫胶体金技术、乳胶凝集试验、血凝试验快速简便易操作但敏感性较低。ELISA方法特异性强、敏感性高、快速简便，在兽医临床、流行病学调查中应用越来越多，技术也越来越成熟，相关检测试剂盒陆续被开发和应用。但该技术的稳定性亟待提高，操作过程中各个环节均可对检测结果产生较大影响，因此技术操作的规范化与标准化显得尤为重要。这样才能使得不同实验室与不同操作员得到的检测结果均具有参考价值，进而更好地应用于兽医临床疾病诊断和生产实践。