新生儿缺氧缺血性脑损伤中无菌性炎症反应的研究进展

师 睿，阴怀清

新生儿缺氧缺血脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是由于产时窒息导致的严重脑损伤，可造成脑组织局灶性坏死和神经细胞死亡、弥漫性白质损伤、囊性或空腔梗死等损害，是新生儿死亡及小儿癫痫、脑瘫等远期后遗症的主要原因[1]。HIE造成的新生儿死亡约占全球新生儿死亡人数的25%[2-3]。该病每年的发病率为0.15%[4]，发展中国家的发病率更高。HIE造成的脑损伤随着时间呈进行性发展，这一过程与神经炎症反应的激活密切相关[5]。近年来，研究发现，缺氧缺血导致的脑细胞损伤或坏死后释放的损伤相关分子模式(damage-related molecular patterns，DAMPs)，包括高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)、热休克蛋白(heat shock protein，HSPs)、S100钙结合蛋白等，通过激活先天性免疫系统的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)诱导炎症反应，进一步加重HIE的脑损伤，因此，这些DAMPs或许可以作为研究HIE治疗策略的新靶点或生物标志物。本研究就DAMPs引发的无菌性炎症在HIE中的作用机制及研究进展进行综述。

1 无菌性炎症反应机制

在病原微生物引起的炎症反应中，天然免疫反应提供了抵御病原体入侵的第一道防线。由巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、肥大细胞等组成的天然免疫系统通过PRRs识别一些特定的病原菌及其产物，如肽聚糖、脂多糖、DNA、RNA等具有某些共同的非特异性、高度保守且对病原体生存和致病性必要的分子结构，即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引起宿主的固有免疫反应。此外，研究发现由受损或坏死细胞释放的细胞内容物中的某些分子，也能够激活先天免疫细胞的PRRs，诱发免疫反应，这些分子统称为DAMPs，由于DAMPs引发的炎症反应与病原体感染无关，因此被称为无菌性炎症[6]。

DAMPs是指机体自身细胞所释放的内源性危险信号，由一些受损或坏死组织及某些激活的免疫细胞释放[7]。正常情况下这些分子存在于细胞内，不被机体免疫系统识别，当细胞遭受缺血或创伤等刺激，细胞坏死导致细胞膜完整性丧失，细胞内容物释放到细胞外空间，通过结合非免疫细胞(如上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞)及天然免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)上的PRRs，激活无菌性炎症[6]。来自坏死细胞的典型DAMPs包括HMGB1、HSPs、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和尿酸等。DAMPs还包括一些细胞外基质碎片，例如透明质酸、硫酸乙酰肝素等[6]。在细胞内储存的促炎细胞因子和趋化因子如白细胞介素(IL)-1α、IL-33等，为条件性或者诱导性DAMPs，可在一定条件下由坏死细胞释放介导无菌性炎症反应[8-10]。目前已知的PRRs包括Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)、NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)、维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(retinoic acid-induced gene Ⅰ-like receptors，RLRs)、C型凝集素受体(C-type lectin receptor，CLS)和DNA环状传感器[11]。还有许多非PRRs跨膜蛋白，包括晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、髓细胞触发受体(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREMs)、几种G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)和离子通道也被证明可结合DAMPs。这些受体主要分布于固有免疫细胞表面，可激活启动多种信号通路，促进各种免疫细胞的迁移和激活，释放促炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ)[7]。

2 DAMPs在HIE脑损伤中的作用机制

2.1 HIE脑损伤中的免疫细胞 动物实验证明，随着孕期进展，发育中的大脑越来越容易受到HIE的损伤，这是因为HIE引起的能量缺失使得处于高代谢水平的大脑代谢严重受阻，从而引起神经细胞大量死亡[2，12]。HIE脑损伤的结局与神经炎症反应密切相关[13]。核心缺血区的能量衰竭和缺氧会触发活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，导致细胞死亡、神经元损伤、血脑屏障破坏和炎症反应的启动[14]。细胞内物质，如核酸(线粒体DNA)、脂质(如氧化磷脂)和蛋白质(如HMGB1、过氧化物酶)释放到细胞外空间，作为DAMPs结合常驻免疫细胞上的PRRs，激活促炎介质的产生[15-18]。

2.1.1 中枢免疫细胞 小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，在缺氧缺血后的炎症及免疫反应中扮演重要角色[19]。正常情况下，小胶质细胞是“静止”状态，维持中枢神经系统稳态。缺氧缺血发生后，小胶质细胞增殖并对损伤诱导的DAMPs释放迅速做出反应。小胶质细胞中PRRs被激活，使得小胶质细胞变成阿米巴样形态，清除凋亡细胞和缺血区域的碎片，同时产生促炎性因子IL-1和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，激活免疫反应，破坏血脑屏障[20-21]。新生儿血脑屏障未发育完善，大量外周炎性因子通过血脑屏障浸润脑组织，引起更严重的脑损伤。激活的小胶质细胞还会产生过多的ROS和一氧化氮(NO)，引起大脑的氧化应激损伤[22]。同时活化后的小胶质细胞还可表现出M2巨噬细胞抗炎表型，释放抗炎和神经营养因子，具备免疫抑制和神经保护特性，能够促进血管生成、组织重塑和神经修复[23]。

反应性星形胶质细胞增生是缺血性损伤后病理改变的另一个标志[24]。缺氧缺血损伤发生后，星形胶质细胞肥大、增殖，Ca2+信号传导增加，导致促炎细胞因子(IL-1、IL-6)和趋化因子的产生[25]，并且在受损的大脑半球形成胶质瘢痕，炎症初期可以起到保护神经元、修复血脑屏障、限制炎症蔓延的作用[26]。但随着损伤加重，反应性星形胶质细胞释放大量神经毒性物质[细胞因子、一氧化氮合酶(NOS)等]损伤神经元，抑制神经再生；同时分泌各种趋化因子，吸引中性粒细胞等外周免疫细胞向损伤部位迁移，进一步加重脑损伤[27]。但是，在成人脑缺血损伤的研究中发现，反应性星形胶质细胞也可产生抗炎细胞因子(IL-9、IL-10和IL-11等)，并通过 TLR3的激活促进组织修复[28]。提示星形胶质细胞在新生儿HIE的炎症及神经修复过程中可能扮演重要角色。

2.1.2 外周免疫细胞 血脑屏障的破坏和中枢固有免疫细胞产生的高水平的促炎介质将吸引缺血区域的外周免疫细胞。中性粒细胞在缺血部位早期被招募，通过MMPs的分泌，以及ROS和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)的产生，参与血脑屏障的破坏[29]。单核细胞在这一过程中初期表现出促炎作用，之后又表达抗炎作用[30]。另外，T淋巴细胞和B淋巴细胞也在血脑屏障破坏后由外周向大脑浸润，产生促炎细胞因子，对大脑造成损伤[31]。

2.2 HIE脑损伤中的无菌性炎症反应 在HIE脑损伤过程中，一些典型的DAMPs通过激活大脑中固有免疫细胞的PRRs激活中枢免疫系统，引起一系列炎症反应，参与神经细胞损伤与修复过程。

2.2.1 HMGB1 HMGB1是哺乳动物细胞内一种高度保守的非组蛋白核蛋白，由215个氨基酸组成，具有高电泳迁移率[32]。正常情况下HMGB1位于细胞核内，作为分子伴侣参与DNA的复制、重组、转录、修复等，在发育的大脑中，还可作为神经突起生长因子发挥作用[33]。然而，在损伤过程中，HMGB1被受损细胞和活化的免疫细胞释放到细胞外空间，作为一种DAMPs发挥促炎介质作用，参与炎症相关疾病的发病机制。研究表明，在成人缺血性脑损伤中，HMGB1从神经元核内转移到脑实质。细胞外的HMGB1刺激谷氨酸释放、促进炎症反应和血脑屏障损伤[33]。在成年啮齿动物缺血性脑卒中模型中，HMGB1可通过识别TLRs和RAGE，激活小胶质细胞，促进神经炎症反应[34]。而在HIE新生儿的外周血中，HMGB1表达增加[35]。Chen等[36]在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型中发现HMGB1在缺氧损伤后3 h就从神经元核内转移到细胞质。HMGB1还可能导致HIE新生大鼠大脑皮层M1/M2小胶质细胞极化失衡，从而导致神经元损伤，而用药物阻断HMGB1信号则会减轻小胶质细胞的这种不平衡极化，减轻神经炎症反应[37]。提示HMGB1可能是围生期窒息所致脑损伤的早期生物标志物，或可作为治疗HIE的新靶点。

2.2.2 S100蛋白 S100蛋白家族由24个成员组成，在细胞内和细胞外均可发挥调节作用。在细胞内，S100蛋白通过与多种靶蛋白(包括酶、细胞骨架亚基、受体、转录因子和核酸)相互作用，参与细胞增殖、分化、凋亡、Ca2+稳态、能量代谢、炎症等活动。细胞外的S100蛋白可作为一种DAMPs，通过激活固有免疫细胞，参与先天性和适应性免疫反应、细胞迁移和趋化作用、组织发育和修复等过程。在神经系统中，星形胶质细胞和神经元亚群中存在S100β，参与脑损伤等病理过程[38]。有研究表明，S100β在中枢神经系统损伤如脑卒中、蛛网膜下隙出血、脑外伤后升高，并与病人预后相关[39]。在儿童中，足月儿窒息后24 h内血清S100蛋白水平升高，被认为与HIE相关。S100蛋白也是衡量新生儿HIE脑损伤程度的标志物之一，在中、重度HIE患儿以及脑瘫患儿中血清S100蛋白水平升高最显著[40]。Bersani 等[41]通过检测亚低温治疗后HIE新生儿尿液中的S100蛋白水平，提出S100蛋白可以作为评估亚低温治疗以及复温时间窗的观测指标。但是关于S100蛋白在HIE脑损伤中的具体机制还有待进一步的研究。

2.2.3 HSPs HSPs主要作为细胞内的分子伴侣，催化蛋白质的折叠、变性蛋白质的复性和引导不可逆损伤蛋白质的降解。在脑缺氧、缺血和应激状态下，HSPs在缺血区域或附近的小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中表达上调，并且通过防止受损蛋白质的聚集和促进新生蛋白质的组装来保护细胞[42]。HSPs还可通过抗凋亡和免疫调节特性发挥潜在的神经保护作用[43]。有研究证明，HSP70在缺氧缺血的婴儿中表达，并且建议测定婴儿脑脊液或母亲血清中的HSP70水平。HSP70升高的时间点可能对产前诊断和终止妊娠至关重要[44]。高表达HSPs转基因大鼠的海马神经元细胞可以抵抗兴奋性毒素和缺氧、缺糖的损害[45]。HSPs还被证明可通过调控神经干细胞/神经祖细胞直接或作为促血管生成因子的来源，修复血脑屏障[46-47]。因此，推测HSPs在HIE后的脑损伤过程中发挥神经保护作用，并且可以用于HIE的早期诊断。

3 小 结

HIE后诱导的DAMPs释放激活固有免疫细胞的PRRs引起的无菌性炎症反应在新生儿脑损伤的过程中起重要作用。在新生儿HIE脑损伤的过程中，一些DAMPs(如HMGB1)作为炎症诱导因子激活小胶质细胞在内的中枢免疫系统，引起神经细胞损伤；而在后期的损伤修复过程中，一些分子如HSPs等可以对抗一些蛋白的错误折叠，从而起到神经保护的作用。另外，这些DAMPs的表达水平因时间进展而有所不同，因此，其也可以作为新生儿HIE脑损伤的生物标志物，指导HIE治疗。目前，对于新生儿HIE的主要治疗仍为亚低温治疗，但是其远期疗效欠佳。因此，针对炎症和免疫失调的辅助治疗可能有助于提高低温治疗的整体疗效，进一步改善HIE患儿的病死率及远期后遗症的发生。