α地中海贫血的实验室分子诊断技术进展

覃柳群 罗世强 严提珍

1.柳州市妇幼保健院医学遗传科 广西 柳州 545001

2.柳州市出生缺陷预防与重点实验室 广西 柳州 545001

3.柳州市妇幼保健院生殖与遗传研究所 广西 柳州 545001

α-地中海贫血（以下简称α-地贫）是我国南方地区最常见的单基因遗传病之一，中国长江以南各省区多见，尤以广西、广东和海南三省最为严重。广西和广东两省的发病率分别高达14.95%、8.53%[1]。此病主要是由于α珠蛋白基因缺失所引起的典型基因缺失遗传病，最常见的类型是α-地中海贫血和β地中海贫血，其临床表现和分型与目的基因的缺失直接相关，临床暂无有效的治疗方法，筛选出合理的实验室诊断技术对该病的预防具有重要的意义。本文就目前应用于α-地中海贫血的标本种类及多种实验室分子诊断技术作一综述。

1 样本采集、运送及保存

不同的抗凝剂对PCR扩增的影响是不同的，例如肝素抗凝的血液标本经DNA提取后仍会影响PCR的扩增效率。血液的新鲜程度也会影响DNA提取的质量。目前用于地贫检测的标本极大多数都为EDTA抗凝全血，标本需要保存于4摄氏度冰箱，在运送过程中也需格外注意，不得颠簸、倒放及高热以防渗漏、溶血等造成交叉污染。骆明勇等[2]发现将150份干血斑标本存放6、9个月后依然能够稳定地进行地贫基因检测。该方法为地贫基因检测提供了一种方便的标本采集方式，特别适用于标本采集困难的检测对象。另外，现在不少单位已在新生儿中采用干血斑进行血红蛋白地贫筛查，不用再次采集标本，该方法将在地贫标本转诊网络建设中发挥重要的作用。

1.1 缺口PCR技术（Gap-PCR）

缺口PCR的原理是进行2对或者3对引物的设计，也就是在缺失区域的外侧，在与缺失位点临近的地方进行1对引物的设计，在缺失区域里面进行1对引物的设计。在正常人和杂合子中处于缺失区域中的引物能扩增片段，同时如果是缺失纯合子，则不能扩增。通过缺口PCR方法的应用，可以将三种缺失型地中海贫血准确检测出来[3]。缺失序列、设计引物两侧翼序列互补，原本正常情况下处在断裂点两侧翼相距遥远的引物由于基因缺失突变变得临近，因而实现一定长度片段的扩增；缺失区域有另外一对引物，当处于杂合子情况或完全正常情况下，才能够完成正常等位基因的扩增。这一方法依据扩增片段大小能实现正常杂合子、纯合子个体的准确区分[4]。

1.2 反向点杂交法（PCR-RDB）

反向点杂交法（PCR-RDB）其原理是将扩增的DNA与固定在尼龙扎带上的突变特异性探针杂交。PCR扩增产物和探针通过分子杂交反应及显色反应，观察检测膜条上各位点信号的有无，判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待检样品的基因型[5]。α-地贫分为缺失型和非缺失型，目前主要用PCR结合反向点杂交（RDB）法检测3种α点突变(αCSα、αQSα、αWSα)[6]。

1.3 多重连接依赖式探针扩增技术（MLPA）

MLPA 是一种多重连接依赖式探针扩增技术。基本原理是把目的基因复制到依赖探针上，再用一对通用引物扩增捕获到的目的片段，通过对扩增产物进行毛细管电泳分析得出目的片段异常的结果。此技术操作简单，24小时内可出结果，自动化程度高，有相应的数据分析程序。Liu等[7]应用覆盖α-珠蛋白基因的MLPA探针对118例标本进行检测，不仅准确地检测出单一缺失，如：-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα 等，还可以检测出复合缺失如-α4.2/--SEA等，特异性和敏感性达100%。郝颖等[8]89对夫妇双方或一方为α地贫基因携带者的家系中的胎儿样本,同时用Gap-PCR技术和MLPA技术进行检测α珠蛋白基因的缺失。结果88份胎儿样本的MLPA检测结果和Gap-PCR检测结果完全一致；1份胎儿样本（绒毛组织）经Gap-PCR检测未能确诊，后结合MLPA检测确诊为-SEA/αα。

1.4 多色探针荧光PCR熔解曲线法

多色探针荧光PCR熔解曲线法，主要利用改良分子探针对PCR产物进行实时分析的突变检测技术。分别计算出各个样本、校准品的 ΔCt 值（目的基因减去参比基因的Ct值差），再将待测样本的ΔCt减去正常对照样本△Ct得ΔΔCt 计算 2-ΔΔCt即可得到待测样本，相对于校准品目的基因的相对拷贝数。这种目的基因相对定量模式，无需制备标准曲线，可灵敏地检测出基因拷贝数的差异。严提珍等[9]采用 PCR-荧光探针法对303例临床样本进行α珠蛋白基因拷贝数定量检测，检测结果与 Gap-PC R法结果比较分析，结果表明两种方法结果完全一致的有 301例，不吻合的有2例，符合率为 99.34%。这2例经MLPA技术复核，发现检测结果与Gap-PC R法结果一致，且该方法整个检测过程都在封闭的PCR管中进行，PCR和熔解分析仅需一个程序完成，与目前的RDB法和测序法相比，具有明显的高通量和操作简便的优势，同时又大大降低了PCR扩增产物污染的机会。

1.5 基因芯片技术

基因芯片杂交法是在PCR扩增的基础上，应用荧光标记法将大量的寡核苷酸片段或 DNA片段有序排列在固相载体上，称之为基因芯片或DNA阵列，同时提取待检测样品DNA，与芯片杂交，然后扫描芯片的荧光强度，应用生物信息学分析结果，最后得到样品中基因序列和表达水平或突变的相关信息。该技术能快速、准确地从分子水平诊断疾病。王沙燕等[10]和黄培坚[11]都利用基因芯片技术进行α-地贫基因检测，他们认为基因芯片法具有快速、高效、自动化程度高且简便等优点，但由于该技术所需设备和耗材昂贵，限制其在临床推广应用。

1.6 DNA测序

DNA测序技术能够直接准确的对基因突变的位置和性质进行判断，是检测未知地中海贫血基因突变的金标准。Sanger法是最常用的第一代测序技术，该技术为定性实验，不能对大片段的基因缺失进行检测，且费时费力费用高，随着DNA测序技术的进步，出现了高通量测序技术，又称下一代测序技术，它一次能并行对数以百万条DNA分子进行序列测定，对所有类型的地中血进行检测。谭梅等[12]用高通量测序技术在206例受检新生儿中筛查出地中海贫血基因突变的有22例，其中 α-地中海贫血11例，β-地中海贫血11例，新发5例。宋春林等[13]用高通量测序对1368例样本中一共检出了523例（38.2%），共25种地中海贫血基因突变，常规基因检测阴性而高通量测序阳性结果经Sanger测序结果一致。他们认为高通量测序在地贫检测上值得推广。但是DNA序列测定法操作繁琐，所需仪器设备昂贵，极大地限制了其在临床诊断中的应用。

2 总结

目前地贫基因诊断主要采用EDTA抗凝静脉全血，采血量大，不利于对新生儿的采集；采血管的转运也存在低温转运不便及容易破管等许多问题。干血斑是通过采集适量的血液，足跟血、末梢血均可，滴在滤纸片上并干燥而成，具有需要标本量少、便于运输,保存等优点，非常适合血液标本采集和转运.

实验室诊断的总标准是成本低、效率高和方便简单，同时需保证疾病诊断准确性，避免出现漏诊和误诊现象。实验室分子诊断技术中各自有自身优劣势，因此，充分了解每种技术的应用范围及局限性,结合各自实验室的具体情况，寻找到准确、高效、经济的诊断方案，对于各高发地区预防中重型地中海贫血患儿的出生及提高 新生人口素质具有积极且深远的意义。