KANNO血型系统（KANNO，037）的研究进展①

钟 靖 龚晨辉 史华山 李凌波（邵阳市中心医院输血科，邵阳 422000）

人类红细胞膜蛋白的遗传变异可以通过“自然”产生的同种抗体来检测，或通过妊娠、输血等免疫途径产生的免疫抗体来检测，也可通过其他的方法如DNA序列分析来检测红细胞膜蛋白的多态性，但只有DNA分析才能检测到却没有发现相应抗体的多态性不能称为血型系统抗原［1］。2013年以来，共有10个新血型系统被确认，即分子基础为跨膜蛋白SMIM1（基因名SMIM1）的Vel血型系统（VEL，034）［2］，以补体调节蛋白CD59（基因名CD59）为基础的CD59血型系统（CD59，035）［1］，以核苷转运蛋白1（基因名SLC29A1）为基因产物的Augustine血型系统（AUG，036）［3］，朊蛋白（prion protein，PrP）PRNP基因错义突变所确认的KANNO血型系统（KANNO，037）［4］，基于癌症相关的B4GALNT2基因变异而确认的Sid血型系统（SID，038）［5］，以及2021年正式确认的作为胆碱转运体蛋白（编码基因SLC44A2）的CTL2系统、ATP结合盒转运蛋白（编码基因ABCC4）的PEL系统、上皮膜蛋白3（编码基因EMP3）的MAM系统、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（编码基因PIGG）的EMM系统、ATP结合盒转运蛋白（编码基因ABCC1）的ABCC1系统［6］。目前，国际输血协会（international society of blood transfusion，ISBT）已确认由345个红细胞抗原构成的43个人类红细胞血型系统［6］。其中037号KANNO血型系统抗原编码基因产物是KANNO糖蛋白，基因名PRNP，表达红细胞KANNO抗原的糖蛋白为朊蛋白（prion protein，PrP），也称细胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPC），与引起人克雅氏症（creutzfeldt-Jakob disease，CJD）的朊病毒（scrapie prion protein，PrPSC）氨基酸序列完全一致，KANNO糖蛋白肽链上氨基酸发生谷氨酸（Glu）到赖氨酸（Lys）的基因突变（E219K），是KANNO阴性表型的分子基础。本文主要针对KANNO血型系统的研究进展做一综述。

1 KANNO血型系统的发现和血清学

早在1991年，一位49岁姓KANNO的日本妇女因子宫肌瘤入日本福岛医科大学附属医院治疗，因严重贫血（Hb 5.5 g/dl）于5 d内共输注5 U红细胞。该患者既往无输血史，有妊娠史，至输血后第10天间接抗人球蛋白试验（indirect antiglobulin test，IAT）出现微弱阳性，其产生的免疫性IgG抗体与所有鉴定谱细胞均发生反应，不与自身细胞凝集。经详细检测发现，该抗体与所有已知抗体不同，命名为同种抗体抗-KANNO（取先证者名字）［7］。

截至2014年，在日本共发现并鉴定了28例抗-KANNO抗体，含有抗体的28例患者中26例确定为红细胞KANNO抗原阴性，在研究患者含有的抗-KANNO抗体IgG亚型时发现主要为IgG1，亦发现共存的IgG1和IgG2，共存的IgG1和IgG3，以及IgG4。28例中26例是女性，其中25例有妊娠史，全部28例中10例曾有输血史，但未发现发生溶血性输血反应（hemolytic transfusion reactions，HTRs）。调查的全部28例患者中孕妇14例，抗-KANNO导致新生儿红细胞直接抗人球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAT）阳性病例中均未发展成新生儿溶血性疾病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN），除了1例分娩后第2天新生儿总胆红素升至15 mg/dl，接受光疗治疗24 h后缓解，归因于ABO不相容的妊娠。抗-KANNO抗体大都由免疫反应产生，但产生因素由妊娠刺激多于输血刺激，抗-KANNO临床意义不大，可进一步对其抗原生物化学和遗传学进行研究。而研究认为KANNO抗原属于高频抗原，该抗原较少或无临床意义［8］。

2019年，YOSUKE OMAE等［4］通过全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）和全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）方法，确定了编码KANNO抗原的基因PRNP。分析发现，被调查的KANNO阴性的18例个体，其纯合基因型的两条染色体均发生了PrP的PRNP基因第219个氨基酸Glu到Lys的基因突变（E219K）。另外，应用单克隆抗体特异性固定化红细胞抗原（monoclonal antibody specific immobilization of erythrocyte antigens，MAIEA）法，在红细胞特异膜蛋白上定位KANNO抗原，并进一步将抗-KANNO血清应用于表达不同基因候选蛋白的细胞，发现抗-KANNO仅与表达正常基因PrP的KANNO阳性型细胞结合，而不与表达E219K突变（缺乏Glu）基因PrP的KANNO阴性型细胞结合。说明KANNO阴性表型人PRNP基因发生E219K变异后产生了针对“Glu型”PrP的同种抗体“抗-KANNO”，并由此确定了KANNO是新的红细胞血型系统抗原。研究认为，鉴于亚洲人更容易出现KANNO阴性表型，而输血和妊娠是产生抗-KANNO的关键因素，PrP在这些因素影响下的功能将是KANNO血型未来血清学研究的重点［4］。

2019年8月，ISBT将高频率抗原KANNO正式确认为红细胞血型系统抗原［6］。从而也证实了与人CJD、Gerstmann-Sträussler-Scheinker综合征（Gerstmann-Sträussler-Scheinker syndrome，GSS）、家族性致死性失眠症（fatal familial insomnia，FFI）、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）以及动物的牛海绵状脑病（bovine spongiform encephalopathy，BSE）及羊瘙痒病（Scrapie）等［9-14］朊病毒病有关的PrP是一个新的人类血型。

2 KANNO血型的分子基础及多态性

KANNO血型系统包含1个抗原KANNO，KANNO抗原的编码基因位于20号染色体（4686456-4701588），基因名PRNP［6］。PRNP（NC_000020.11）是一个16 kb的基因，包含两个外显子，外显子1属于一个非编码外显子，可以作为转录起始位点，对调控PrP在细胞中的表达水平有重要作用；编码朊蛋白PrP基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）位于外显子2，该蛋白由253个氨基酸组成（图1）［15］。一项对PRNP基因及独立于PRNP编码序列并与PRNP具有主要基因连锁的PRND（prionlike doppel gene）基因的测序显示，在PRNP的开放阅读框的25 kb范围内已发现56个SNPs位点（图2），PRNP编码区M129V、E219K等发生了氨基酸残基取代，是错义突变，A117A、G124G等未发生氨基酸残基取代，为沉默突变［16］。此外，在PRNP基因密码子51至91之间，存在1个八肽重复区域，组成是由1个九肽（27 bp，R1）及紧随其后的4个八肽（24 bp）重复（R2，R2，R3和R4），可结合一定数量的Cu2+，与PrP构象转变密切相关，4个相同的八肽仅核苷酸序列有小的变异［17］。PRNP的大多数致病突变是错义突变（如E200K、D178N、A117V突变等），但是有几个八肽重复插入（octapeptide repeat insertion，OPRI）突变、一些无义突变（如Q160X替换等）和至少一个的八肽重复删除（octapeptide repeat deletion，OPRD）突变已被鉴定出来也属于致病突变［17］。编码KANNO血型抗原的PRNP基因具有丰富的多态性，红细胞膜蛋白上这些变异中的一个（E219K）已经被同种抗-KANNO抗体所定义，并构成了KANNO抗原表位表达的基础。可以设想，人红细胞PrP的PRNP基因的其他多态性如果针对某种氨基酸也产生相应的同种抗体并被鉴定，那么KANNO血型系统将可能会有新的抗原加入进来。

图1 PRNP的氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of PRNP

图2 P RNP-PR ND基因座位点图，包括与PRNP外显子1和2相关的SNPs位点［16］Fig.2 Line drawing of P RNP-PR ND locus，including location of SNPs relative to PRNP exons 1 and 2［16］

KANNO抗原的表达是由PRNP肽链的第219位氨基酸所决定，由PRNP编码区655～657 bp处密码子GAG转录翻译，产物是219位Glu，当基因发生c.655G＞A突变，翻译产物的氨基酸发生G219L（E219K）突变，219位氨基酸残基变为Lys，成为KANNO阴性表型（纯合基因型，K/K）形成的分子基础（表1）［4］。该突变曾在一位患有GSS的日本患者PRNP基因的开放阅读框中被发现［18］，该患在PRNP基因102密码子发生脯氨酸（Proline，Pro）到亮氨酸（Leucine，Leu）突变的同时出现了219密码子Glu/Lys（E/K）杂合子的多态性。这一多态性导致最常见的带负电荷的Glu被带正电荷的Lys替代，且发现这一GSS家族患病者与之前报道的仅有PRNP基因102密码子突变病例在临床病理方面具有明显不同。E219K变异是日本人群的一种正常多态性，等位基因频率为12%，219位点Lys等位基因频率为6%［18］，KANNO阴性表型频率为0.4%～0.7%［4］。在意大利亦进行了类似研究，选取100例健康对照人群、70例CJD病例及34位发病者家族中的正常人群，对PRNP基因219位多态性进行研究。结果在所有的受检者中均未发现219位E/K基因型多态性，推测不同地域结果的差异很大程度上与受研究人群种族背景的不同有关［19］。韩国对健康人群展开129、171、219位点等多态性研究发现，韩国健康人群219位点Lys等位基因频率为4%，E/K基因杂合子频率为7.94%，低于上述日本健康人群［20］。E219K突变主要存在于日本及其他东亚人群，一项对中国626例健康人群E219K多态性研究显示［21］，中国不同民族人群E/K基因型频率不同，汉族（10.2%）、回族（4.5%）、维吾尔族（2.2%）。另一方面，维吾尔族（98%）和回族（96%）219位残基E/E频率高于汉族（90%），中国汉族的219位K等位基因频率（5.1%）、回族（2.3%）和维吾尔族（1.1%），但目前没有在219密码子发现K/K纯合基因［21］。在世界范围，已知PRNP基因219位E/K多态性基因频率亚洲为2.6%，中东/北非为0.6%，大洋洲为5.6%［22］。另外，KANNO阴性表型在亚洲巴基斯坦和美洲古吉拉特（Gujarati）印第安人中均有发现，频率分别约为1.04%和1.94%［4］。

表1 PRNP基因核苷酸和氨基酸变化预测及KANNO血型系统表型Tab.1 Nucleotide and predicted amino acid changes in PRNP gene and KANNO blood group system phenotypes

3 KANNO糖蛋白的生理生化

PRNP基因编码翻译产物是KANNO糖蛋白，已证实为PrP［4］。KANNO糖蛋白亦属于膜分化抗原CD230，是人类细胞表面重要的肿瘤标志物，PrP在不同类型的肿瘤中过度表达，与不良预后和治疗抵抗有关［23］。PrP不仅表达在红细胞膜上，还主要存在于人脑、心脏、骨骼肌、肾脏、二级淋巴器官等多种组织细胞中。其中，在脑和脊髓神经元、神经胶质细胞、白细胞等的表达量相对更高［24-25］。PrP是哺乳动物中高度保守的膜锚定蛋白，可通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）锚定在细胞膜上。人PrP（HuPrP）肽链由253个氨基酸组成，分子量33～35 kD，PrP含有以下特征性区域：N端片段（N-terminal fragment，NTF）信号肽，一个八肽重复区，蛋白质中央高度保守的疏水区、C端片段（C-terminal fragment，CTF）疏水区［26-29］。KANNO糖 蛋 白的第219位氨基酸位于HuPrP折叠域结构的C端第3个α螺旋区域内，接近PrP在红细胞膜的GPI锚定部位，第1个α螺旋的侧面是1个双链反向平行的β折叠，其中第2个β折叠和第3个α螺旋间有1个大的环状结构，KANNO阴性呈现219位Glu到Lys的突变（图3）。

图3 HuPr P（E219K，KANNO阴性）的折叠域结构3D图示（PDB代码2LFT）Fig.3 3D structure of the folded domain of HuPr P（E219K，KANNO-negative）（PDB code 2LFT）

PrP在内质网（endoplasmic reticulum，ER）合成并完成翻译后修饰过程，最初经转录翻译后得到的PrP蛋白含有253个氨基酸残基，随后N端22个氨基酸残基在修饰过程中作为信号肽被裂解［30］。肽链的C末端亦有23个氨基酸残基被切除，并与GPI锚链连接，后经过高尔基体运输，分泌到细胞表面，通过GPI锚固定于细胞膜的磷脂双分子层［31-33］。因此锚定在红细胞膜上GPI的KANNO糖蛋白肽链只有208个氨基酸，在运输到高尔基体前，PrP会在内质网形成部分折叠并形成二硫键［34］。当PrP从高尔基体运送到质膜表面时，PrP会存在非糖基化、单糖基化和双糖基化三种形式［35］。但有研究表明，PrP糖基化与否对其结构和功能并无明显影响［36］。

PrP有两种构象异构体PrPC和PrPSc，通常PrPSc产生一个较小的耐受蛋白酶分子，约142个氨基酸，称作PrP27-30，TARABOULOS等［37］用抗PrP27-30抗体分别检测未经蛋白酶K处理的正常动物和羊瘙痒病感染动物的脑组织提取物，首次发现PrPC和PrPSc的存在。1986年BASLER等［38］通过PrP的部分序列克隆其同源互补DNA（cDNA）基因，确定了PrPC和PrPSc由同一PrP基因编码。PrPC为正常PrP，生理状态下PrPC具有可溶性，对蛋白酶K敏感，在细胞代谢过程中，可被蛋白酶完全降解、清除。PrPC作为一种细胞膜表面糖蛋白，参与细胞之间信号跨膜转导、细胞黏附、Cu2+代谢、抗细胞凋亡、抗氧化应激等过程，敲除该基因可导致与昼夜节律有关的动物行为异常，亦与人及动物肿瘤、细菌及病毒性疾病等的发生发展相关［39-43］。PrPSc为异常蛋白，是PrP致病形式，不溶于水溶液，能抵抗蛋白酶K酶解作用，具有致病性和传染性［44］。一般认为动物组织中出现PrPSc的原因是自身PrP基因突变、PrP基因翻译错误或感染了外源的PrPSc所致［38］。PrP基因突变和翻译错误可诱发PrPC发生蛋白质错误折叠，导致三维构象发生变化而产生PrPSc，而作为病原体的PrPSc在感染动物后以自身为模板，与体内正常表达的PrPC相互作用，将后者转变成为具有感染能力的PrPSc，并逐步在体内聚集，引起动物和人朊病毒病［14］。PrPC和PrPSc在一级结构氨基酸序列上并无差异，但二级结构特征出现明显差异，PrPC转变成PrPSc的过程不涉及任何翻译后共价化学键的修饰，仅空间结构中α螺旋和β折叠所占比例发生改变。PrPC的α螺旋占43%，β折叠占3%，以α螺旋为主；而PrPSc的α螺旋占30%，β折叠占43%，以β折叠为主［45-46］。提示PrP理化性质和生物学性质的改变可能仅与其空间结构的改变有关。另外，OPRI似乎没有直接影响PrP的构象，但功能研究表明，额外的两个或两个以上的八肽重复使PrPC对蛋白酶更有抗性，更容易聚集，这可以促进PrPSc的形成，八肽重复膨胀也会影响铜与PrP的结合，从而增加两者之间的相互作用并有可能降低PrPC的稳定性和耐聚合性［47］。PrPC在其构象形成过程中具有内在的向PrPSc构象转变的倾向，因此朊病毒病的发生始于PrPC向PrPSc构象转变，PrPSc进而引起蛋白质的进一步聚集，最终在动物大脑组织中出现淀粉样蛋白沉积斑块，可见由PrPC向PrPSc转变是朊病毒病发生的关键［48］。

尽管人们认识到PrPC向PrPSc转化是疾病发生和发展的关键，但PrPSc如何复制和传染，具体的机制仍不明确，目前对PrPC转变为致病性PrPSc的解释有3种假说［49］。其一为再折叠模型：假设PrPC发生去折叠达到一定程度，进而在PrPSc直接或间接影响下发生重折叠，形成折叠异常的致病性PrPSc；其二是种子模型：假设PrPC和PrPSc处于热力学平衡，而PrPSc单体不稳定，聚集在一起后变得稳定，PrPSc聚集体通过结合PrPC单体促进PrPC的转化，使平衡向形成致病性构象的方向移动；其三是模板辅助转化模型：假设PrPSc在热力学上比PrPC更稳定，但PrPC转变为PrPSc需要克服能量障碍，在没有PrPSc存在时，PrPC转变为PrPSc的速度较慢，在PrPSc存在时，其与PrPC的结合降低了转变所需的活化能，使PrPSc迅速增加，这种模式能够解释由于点突变而引起的基因朊病毒病（genetic prion diseases，gPrDs）。后两种模式并不互相排斥，在PrPSc繁殖过程中有可能是这两种模式共同作用。

4 KANNO血型基因与疾病

PrP是人红细胞KANNO血型抗原，可表达在红细胞膜表面，有独立染色体基因位点，编码PrP的PRNP基因存在于所有正常哺乳动物。HuPrP基因（PRNP）具有多种天然多态性，迄今为止已报道了全部超过60种PRNP突变，突变类型包括错义突变、无义突变、八肽重复区的OPRI突变和OPRD突变等，目前能明确分类的突变类型超过40种［47］。

PrP基因（PRNP）突变是引起gPrDs的唯一已知原因，gPrDs是一种常染色体显性突变［38］。gPrDs是由PRNP突变产生的PrPSc在脑内沉积所致，PrPSc具有传染性和自我繁殖性，另外，PrPC转化为PrPSc的过程可能也会导致神经损伤和损失［14，47］。多数gPrDs或表现为迅速发展的痴呆、共济失调、肌痉挛等几个月就死亡；或表现得缓慢，经过几年的过程有轻度认知障碍、共济失调、帕金森症和老年痴呆；然而一些非常罕见的突变，在几年甚至几十年内有神经精神障碍和全身症状。根据PRNP突变类型、临床特征及中枢神经系统组织病理改变将gPrDs分为3类：以皮层广泛分布的海绵状改变为特征的遗传性克雅氏症（genetic Creutzfeldt-Jakob disease，gCJD），以丘脑神经元局灶性丢失和胶质增生为特征的FFI，以PrP抗体染色阳性的淀粉样斑块大量沉积为特征的GSS。当前，已报告有23种PrP基因突变与gCJD的发病有关（P105T、G114V、R148H、D178N、V180I、T183A、T188A、T188K、T188R、T193I、K194E、E196A、E196K、E200K、E200G、V203I、R208H、V210I、E211Q、I215V、A224V、M232R、P238S），1种突变与FFI有关（D178N-129M），至少16种突变与GSS的发病有关（P84S、P102L、P105L、P105S、A117V、G131V、S132I、V176G、H187R、F198S、D202N、E211D、Q212P、Q217R、Y218N、M232T），另外有12个OPRI突变和1个OPRD突变被报告与gPrDs发病相关，6个与AD相关的致病性无义突变被报告位于C终端区的145、160、163、178、226和227密码子［47］。

PrP基因的某些SNPs与gPrDs的发生关系复杂，有两个常见的多态性位点：129位氨基酸残基由甲硫氨酸（Met）突变为缬氨酸（Val）（c.385A＞G：M129V）；219位残基由谷氨酸（Glu）突变为赖氨酸（Lys）（c.655G＞A：E219K）。这两个多态性位点在gPrDs的发病过程中发挥重要作用。PRNP第129位密码子可编码甲硫氨酸（Met）、缬氨酸（Val），可表达基因型为M129M、M129V、V129V，129位密码子多态性与gPrDs的易感性、临床表型和病理特点有关，M129V被认为在散发型CJD（sporadic CJD，sCJD）、医源型CJD（iatrogenic CJD，iCJD）、传统型CJD（classical CJD，cCJD）中均发挥作用，纯合子（M/M）型突变与欧美人中sCJD和变异型CJD（variant CJD，vCJD）的风险增加相关，但在亚洲人中不相关［51］。另外，如D178N突变，D178N伴129M时，临床表现为FFI，而D178N伴129V（D178N-129V）时，临床表现为gCJD［47］。KRASNIANSKI等［52］对6种突变类型的91例gPrDs患者的临床资料进行分析时发现，M129M型占较大比例，且该类型患者与M129V、V129V型相比，发病年龄低、生存期短。

另一影响gPrDs发生的多态性位点是219密码子（rs1800014），其中纯合基因型的两条染色体均发生E219K突变表现为KANNO阴性。这一突变最早由KITAMOTO等［52］在日本精神分裂症患者基因组中发现。现已知该突变存在于日本及其他东亚或东南亚正常人群，而在欧洲人群中极少发现［54］。第219位E/K杂合子基因型占日本正常人群12%，但在CJD患者中则未发现E/K基因型［18］，推测PRNP基因上的E219K可能对sCJD有保护作用。CJD监测项目在东亚人群中发现了E219K多态性的高发生率，没有确诊的CJD患者携带这种多态性，这表明E219K杂合现象可能是CJD的一个保护性因素［55］。Ivana等利用重组磁共振结构的HuPrP（残留物90-231）携带E219K多态性，发现E219K多态性的保护是由于改变了表面的电荷分布，此外还影响了朊病毒转换的关键抗原决定簇细微的结构并重新排列［56］。尽管E219K杂合性显示对sCJD的发展具有显著的保护作用，但这种基因型并不能完全保护朊病毒病的获得型或遗传型形式，密码子219位基因型的影响在散发型、获得型和遗传型之间的差异原因尚不清楚，但可能与最初生成的PrPSc数量有关［57］。

5 展望

KANNO红细胞血型在2019年8月被确认为第37号血型系统。在那之前，人血清中特异性的抗-KANNO抗体已被发现，表达KANNO抗原的蛋白质被鉴定，其基因也已被克隆。与Konps系统类似，鉴于KANNO系统抗原抗体亦不导致HTRs和HDFN，其对输血安全影响不大［58］。且编码KANNO抗原的基因PRNP编码正常PrPC和致病性PrPSc，PrPC和PrPSc又与KANNO抗原具有相同的抗原表位（氨基酸序列），这使得今后对KANNO系统的研究将主要集中在更准确地探究KANNO血型抗原和抗体对疾病的影响，以及在疾病诊断甚至是治疗中的作用。

当前，已明确定义人KANNO阴性表型是PrP基因一个多态性突变，这种突变在日本以外的亚洲人群中以约5%比例存在，且几百人中就有1人携带纯合子。另一有趣的发现是，当人一条染色体发生这种突变时，对gCJD具有很强的抵抗性，因此KANNO血型对朊病毒病的影响也备受关注，对亚洲人KANNO血型与朊病毒病关系的研究也更有意义。

朊病毒病一直备受关注，其病因主要是在人或动物脑组织内出现并沉积大量异常的PrPSc而导致神经细胞死亡。诊断朊病毒病的金标准是检测到PrPSc，但因正常人体内也存在的PrPC与致病性PrPSc相比，仅在空间构象上不同，所以检测PrPSc并不容易。鉴于KANNO阴性表型人产生的抗-KANNO是针对“Glu型”PrP的免疫性抗体，可以设想一种检测红细胞上PrPSc的方法。可以采集KANNO阴性表型人含抗-KANNO的血浆（抗-KANNO特异性针对Hu-PrP基因219密码子的Glu），然后制备疑似患朊病毒病患者的红细胞，使用蛋白酶K处理消化破坏红细胞上PrPC（亦破坏KANNO抗原），保留红细胞上的PrPSc（对蛋白酶K具有抗性），则在Coombs试验中，IgG型抗-KANNO可与蛋白酶处理后的红细胞上PrPSc发生反应。理论上，这可以成为利用血凝试验检测人群中高频率KANNO阳性表型人PrPSc的一种简单易行的新方法。