水茄叶片总皂苷超声提取工艺的研究

王文萱，李云鹏，徐鹤宁，赵 鑫，马 柔，张丽娜，张莹莹

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

皂苷(saponin)也叫做皂角苷、碱皂体、皂素、皂甙或皂草苷[1]。皂苷广泛存在于陆地高等植物中，是植物中重要的次生代谢产物之一[2]，具有杀菌、化感、杀病毒、杀虫等多种生物活性，在植物抵御病虫害过程中发挥着重要作用[3]。水茄(Solanum torvumSwartz.)为双子叶植物纲茄科茄属亚灌木，为药食同源类野生植物[4]，也是茄科植物保护地嫁接栽培中常用的抗病砧木[5]。水茄叶片提取物和代谢物中的多种甾体皂苷具有细胞毒性、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗抑郁和抗糖尿病活性，可用于营养品和多种草药天然配方的新成分[6]。水茄植株提取物能显著抑制多种植物病原真菌的生长；水茄叶部提取物对植物病原菌的抑制活性最好[7]。水茄叶片提取物能够抑制霉菌毒素的产生，可作为抗真菌剂的来源，抑制真菌对植物的侵害，防止果品采后真菌感染和霉菌毒素污染[8]。RAJESH等[9]从水茄叶片的提取物中分离出了抗真菌化合物，经分析鉴定为一种甾体皂苷。综上所述可见，水茄叶片皂苷在医学、食品、农用方面都有很高的研究和利用价值。

响应面法(response surface methodology，RSM)是常用的对工艺过程进行优化的方法，它能够直观地显示出所设响应值与不同因素的函数关系，通过公式、图表的分析筛选出最佳优化条件[10]。应用响应面法可以了解到多个变量之间相互影响的关系，能够准确地评估不同变量及其间交互作用对响应值的影响[11]。目前，响应面法在优化皂苷[12]、多糖[13]、黄酮[14]等天然活性物质的提取工艺中有广泛的应用。

关于水茄总皂苷的提取工艺研究，目前尚未见报道。本试验以水茄叶片中总皂苷提取率为评价指标，通过单因素试验考察乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对提取率的影响；在单因素试验的基础上，进行响应面试验设计，对水茄叶片中总皂苷的超声辅助提取工艺进行优化。以期提高水茄叶片总皂苷的提取率，为日后水茄叶片总皂苷的研究和利用奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：采集水茄健康叶片，洗净晾干。

试剂：薯蓣皂苷（纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司），无水乙醇、甲醇、石油醚、正丁醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CHY-6001多功能粉碎机，金华市莫菲家用电器有限公司；CP224S电子天平，德国Sartorius公司；SB5200DT超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(III)型循环水真空泵，天津华鑫仪器厂；UV-1780紫外分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；HWS28型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；DHG-9240A电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 材料前处理 将晾干的水茄叶片粉碎过40目筛，备用。

1.3.2 水茄叶片中总皂苷提取方法 称取叶片粉末，倒入具塞锥形瓶中，以乙醇作为提取溶剂，加盖摇匀，在超声波清洗器中进行辅助提取，抽滤得提取液，旋转蒸发呈膏状，用蒸馏水溶解，在分液漏斗中，用石油醚萃取脱脂，再用饱和的正丁醇溶液萃取，将正丁醇相旋转蒸干，加蒸馏水溶解。

1.3.3 标准曲线的制作 以薯蓣皂苷为标准品，参照文献[15]，用香草醛-冰乙酸/高氯酸法[16]进行显色，随行试剂做空白参比。绘制横坐标为薯蓣皂苷浓度，纵坐标为吸光度值的标准曲线，求出回归方程。

1.3.4 总皂苷浓度和提取率 水茄叶片中总皂苷浓度和提取率的计算见公式(1)和(2)。

式中：C为总皂苷浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；N为测定吸光度时的稀释倍数，M为水茄叶片质量，g。

1.3.5 单因素试验

（1）乙醇浓度

分别以体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取，料液比1:5，温度50℃，超声功率辅助提取30 min。

（2）料液比

分别以料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25进行提取，乙醇浓度80%，温度50℃，超声功率辅助提取30 min。

（3）提取时间

乙醇浓度80%，料液比1:5，温度50℃，分别超声辅助提取30、60、90、120、150 min。

（4）提取温度

乙醇浓度80%，料液比1:5，分别以40、50、60、70、80℃，超声辅助提取30 min。

1.3.6 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，应用Design-Expert 10分析软件[17]，选择Box-Behnken设计，以水茄叶片总皂苷提取率为响应值，设计自变量为乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度的四因素三水平响应面优化试验。试验因素水平见表1。

表1 响应面设计因素及水平

2 结果与分析

2.1 薯蓣皂苷溶液的标准曲线

标准曲线绘制以薯蓣皂苷浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标。依据标准曲线，可得回归方程(3)。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对水茄叶片中总皂苷提取率的影响 如图1所示，当乙醇浓度在50%～80%时，随乙醇浓度升高，水茄叶片总皂苷提取率也逐渐升高。当乙醇浓度升到80%，提取率达到最大值。乙醇浓度较低时，提取率也较低，这可能是因为在提取溶剂中水的占比较多，多糖等水溶性物质溶出比皂苷类物质多[18]。因此，选择乙醇浓度80%作为试验设计的中水平。

图1 乙醇浓度对超声提取水茄叶片中总皂苷的影响

2.2.2 液料比对水茄叶片中总皂苷提取率的影响 如图2所示，当料液比在1:5～1:15(g/mL)时，随着料液比的增加，水茄叶片总皂苷提取率也随之逐渐升高。在料液比达到1:15(g/mL)时，提取率达到了最大值。当液料比在1:15～1:25(g/mL)时，随着料液比的增大，提取率逐渐下降，这可能是因为随着溶液体积的增大，体系中水也逐渐增多，会使部分多糖类物质溶解[19]，阻碍皂苷成分的溶出，从而影响提取率。因此，选择料液比1:15(g/mL)为试验设计的中水平。

图2 料液比对超声提取水茄叶片中总皂苷的影响

2.2.3 提取时间对水茄叶片中总皂苷提取率的影响 如图3所示，当时间在30～90 min时，提取时间逐渐变长，水茄叶片总皂苷提取率也随之升高。在提取时间达到90 min时，提取率达到了峰值。当提取持续时间超过90 min后，水茄叶片总皂苷提取率随时间变长反而下降，这可能是因为皂苷类物质发生了氧化和降解等因素的影响[20]，所以提取率逐渐下降。因此，选择提取时间90 min作为设计的中水平。

图3 提取时间对超声提取水茄叶片中总皂苷的影响

2.2.4 提取温度对水茄叶片中总皂苷提取率的影响 如图4所示，当温度在40～60℃时，随提取温度的升高，水茄叶片总皂苷的提取率也在逐渐升高，这可能是因为在一定范围内，温度越高传质过程越易进行，随着温度的升高分子扩散也随之变剧烈，温度加快了溶质的扩散，有利于活性物质溶出。然而在60～80℃区间内，水茄叶片总皂苷提取率缓慢下降，可能是因为在高温下部分不稳定的皂苷类物质被破坏[21]。因此，选择60℃作为设计的中水平。

图4 提取温度对超声提取水茄叶片中总皂苷的影响

2.3 响应面试验结果与优化分析

2.3.1 响应面试验结果 通过Design Expert 10软件，设计自变量为乙醇浓度、料液比、提取时间和温度的四因素三水平试验。试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

通过Design Expert 10软件进行数据分析，得到如下回归方程(4)。

由表3可知，响应面模型P=0.0001＜0.001，表示该模型差异极显著。失拟P=0.0977＞0.05，模型失拟项没有显著性差异，模型总决定系数R2=0.9851，调整决定系数R2(Adj)=0.9702，以上3项表明该模型拟合性良好。预测决定系数R2(Pred)=0.9200，表示模型预测性良好；CV值为2.41%，表明试验操作严谨可信；信噪比(Adeq precision)为30.925＞4，表示试验结果能够被得到的回归方程很好地解释。综上所述，认为超声提取水茄叶片总皂苷可以用此回归方程进行结果预测。

表3 方差分析结果

续表3

2.3.2 响应面分析 通过表中各因素P值可知，C（提取时间）、D（提取温度）这2个因素对总皂苷提取率的影响极显著，B（料液比）影响显著，A（乙醇浓度）影响不显著；AB、AC、AD、BC、BD、CD各因素间的交互作用对响应值的影响不显著。二次项总体影响极显著(P＜0.001)。由F值的大小可判断，在选择的水平范围内，各因素影响总皂苷提取率的顺序为提取时间(C)＞提取温度(D)＞料液比(B)＞乙醇浓度(A)。根据试验数据，利用软件绘制响应曲面和等高线，可直观的显示出任意2种因素对皂苷提取率的影响，见图5～10。

图5 乙醇浓度和料液比对总皂苷提取率影响的等高线及响应曲面

图7 乙醇浓度和提取温度对总皂苷提取率影响的等高线及响应曲面

图8 料液比和提取时间对总皂苷提取率影响的等高线及响应曲面

图9 料液比和提取温度对总皂苷提取率影响的等高线及响应曲面

图10 提取时间和温度对总皂苷提取率影响的等高线及响应曲面

由图5～10可知，任意2个影响因素相互影响的响应斜面都有一个最高点，这表示在选定的水平范围内得到的结果有极值，说明各因素选择考察的水平较为适当[22]。响应曲面的斜率越大，各因素水平发生变化时对水茄叶片总皂苷提取率的响应程度越强[23]，所以各因素影响提取率的程度与方差分析结果吻合。各个交互因素的等高线都为椭圆形，表明AB、AC、AD、BC、BD、CD均有交互作用，其中CD的等高线更加接近于圆形，所以表明，时间和温度交互作用最弱，BD的交互作用最强但P＞0.05，影响并不显著。

依据线性二次多项式回归方程可得水茄叶片总皂苷最佳提取工艺条件为乙醇浓度80.30%，料液比1:15.06(g/mL)，提取时间 95.56 min，提取温度62.29℃，此时，水茄叶片总皂苷的理论提取率为38.82%。

2.4 水茄叶片总皂苷超声提取最优工艺验证

对最佳工艺进行3次重复平行验证实验[24]，3次实验总皂苷平均提取率为38.60%(RSD=0.24%)，与模型预测结果相吻合。实验结果可证明，响应面法优化总皂苷提取工艺重复性良好，优化的参数具有实用价值，方案稳定可行。

3 结论及讨论

本试验在单因素试验的基础上，采用响应面法对水茄叶片中总皂苷的超声辅助提取工艺进行优化。研究发现，对总皂苷的提取率的影响，提取时间和温度极显著、料液比显著、乙醇浓度不显著；且各因素之间都有交互作用，其中料液比与温度的交互作用最强。优化后的最佳工艺条件为乙醇浓度80.30%，料液比1:15.06(g/mL)提取时间95.56 min，提取温度62.29℃，在此条件下，水茄叶片总皂苷的理论提取率为38.82%。

对优化工艺进行验证，皂苷平均提取率为38.60%(RSD=0.24%)，与模型预测值有0.24%相对标准误差，本试验严格控制了除变量以外的其他条件，如超声提取时使用的容器、饱和正丁醇萃取的时间等，出现的误差可能是由于超声波清洗机持续工作产生机械热能[25]，一定程度上影响了提取过程。综上所述，验证结果与模型预测结果相吻合，优化的皂苷提取工艺重复性良好，稳定可行，在最优提取条件下，水茄叶片总皂苷的提取率可达38.60%。本试验仅对水茄叶片总皂苷进行了超声波辅助提取法的优化，在此基础上可以进行水茄总皂苷的纯化工艺研究，以期为水茄总皂苷的利用提供技术支持；水茄叶片总皂苷生物活性是否受到提取操作的影响，也有待验证。