呕吐毒素的致病机制及防控措施研究进展

刘义华，谭会泽,2，苗丽萍，陈 丹，彭运智，刘松柏，杨 露，黎鸿彬

(1.温氏食品集团股份有限公司，广东 云浮 527400；2.农业农村部动物营养与健康养殖学重点实验室，广东 云浮 527400)

呕吐毒素属于单端孢霉烯族毒素，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)[1]，主要由镰刀菌属产生，因动物采食被DON污染的饲料后，容易产生采食量降低、拒食，甚至发生呕吐现象而得名[2]。DON最早是在1970年日本香川县暴发的赤霉病大麦中被发现，并在两年后被首次分离得到[3]。它广泛分布于小麦、玉米、大豆等粮食中，是谷物原料和饲料中较常见的霉菌毒素之一[4]。由于其化学性质稳定，在pH7、120℃、60 min的处理条件下，仅有少量被破坏降解，因此，在经过饲料加工、储藏和运输过程后DON仍能稳定存在，很容易进入人类和动物食物链，也因此成为世界上污染最为严重的霉菌毒素之一[5]。DON进入动物肠道后，能通过影响免疫细胞因子生成和免疫细胞增殖从而降低机体的免疫力，还可抑制调节蛋白激酶活性和mRNA翻译[6-7]，从而加速细胞凋亡，严重危害动物健康。因此，采取有效措施去除饲料中的DON，对保障食品和饲料安全以及人和动物健康都具有十分重要的意义。

1 我国饲料和饲料原料中呕吐毒素污染现状

DON主要存在于小麦、大麦、玉米等谷物中，尤其在小麦中的污染最为普遍。我国地域辽阔、作物收获季节气候复杂多变，在东北、西南及华北粮食主产区，在农作物收获季节若遇连续阴雨天气，空气湿度增加，适宜生长的霉菌将会由干生性霉菌(白曲霉、灰绿曲霉)向湿生性霉菌改变，这将导致农作物DON检出率和超标率显著升高[8]。温度和湿度是各种霉菌生长繁殖的重要因素，当谷物含水量为22%，温度为20℃，湿度达85%左右时，霉菌即可产生大量的DON[9]。丁燕玲等[10]通过整理分析“中国知网”等2015～2020年发布的30份调查报告发现，我国大部分地区饲料中存在霉菌毒素污染情况，DON在小麦及麸皮、玉米及加工副产品、豆粕，包括全价饲料中均存在较高的检出率，其中小麦及其副产品中DON检出率连续多年高达90%以上，2020年甚至高达100%。

2 呕吐毒素致病机制

2.1 肠道毒性

肠道是动物最大的消化器官，同时也是最大的免疫器官与微生态环境。肠道内营养吸收面积与转运载体的转运能力是决定肠道营养吸收效率的关键因素，研究表明家禽摄入DON后，肠道丝氨酸转运载体、葡萄糖转运蛋白2/5(glucosetransporters 2/5)以及钠-葡萄糖协同转运蛋白1(sodium-dependentglucosetransporters1，SGLT-1)基因表达量显著降低[11]，导致小肠内糖类、氨基酸等营养物质的转运吸收发生障碍[12]。这类未吸收的糖类、氨基酸到达后肠段后，经过发酵会产生有毒物质，可能是导致畜禽发酵型腹泻甚至呕吐的原因之一[13]。DON进入肠道后刺激肠壁黏膜，导致小肠出现炎症、溃疡，甚至引起肠黏膜出血及坏死性肠炎，原因可能是DON经肠上皮吸收后，破坏动物肠道形态结构[14]。小肠绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)以及二者比值(VH/CD)是反应肠道营养吸收能力的关键指标[15]，肠绒毛、隐窝等部位高蛋白周转率高，更容易受到DON的影响[16]。大量研究表明，DON可以显著改变小肠VH、CD和杯状细胞密度，从而降低肠道对营养物质的吸收[17-18]。肠道同时也是动物机体最大的免疫器官，肠道黏膜是其中重要的组成部分。离体和在体试验均表明，DON可导致肠上皮紧密连接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin和E-cadherin的表达量下降[19-20]。另外，杨婉莹[21]研究发现，DON还能通过诱导上游信号因子造血细胞激酶(Hck)、双链RNA蛋白活化激酶(PKR)的表达，诱导p38丝裂原活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶(p38-ERK1/2)磷酸化，调节p38-ERK1/2通路基因和蛋白的表达，影响小肠各段炎症因子(IL-1β、IL-2和IL-8)的表达和分布，从而诱导肠道产生炎症反应，造成肠道黏膜损伤。

2.2 细胞毒性

DON具有强烈的细胞毒性，其C12，13-环氧基基团会导致细胞氧化应激、造成细胞凋亡、诱导细胞自噬和组织损伤[22-23]，能作用于粘膜上皮细胞、骨髓造血细胞等，造成细胞程序性死亡。线粒体是DON细胞毒性的重要靶点，DON可以抑制核糖体60S亚基上的肽基转移酶活性中心，破坏核糖体的结构以损伤其功能，从而影响细胞中蛋白质的合成过程。DON还可结合到核糖体28S肽酰基转移酶位点，介导细胞凋亡和促炎症细胞因子(如TNF-α、IL-6、COX-2等)的表达，引起机体产生炎症反应，并能够迅速激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，而MAKP作为细胞核心信号，又可以调控下游细胞增殖、分化、凋亡等[24-25]。赵呈祥[26]发现，DON可诱导导致猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)细胞全基因组DNA甲基化水平升高，从而影响核苷酸生物合成、细胞代谢、蛋白信号转导等生理学过程。近几年的研究表明，DON能大量诱导产生活性氧自由基(ROS)，导致细胞发生严重的氧化应激，从而诱导脂质、蛋白质和DNA损伤[27]，李若楠等[28]研究发现，用2.0 μg/ml DON处理IPEC-J2 24 h后，能够诱发细胞脂质过氧化作用，导致细胞凋亡比例和ROS显著升高(P<0.01)。此外，DON还可以通过抑制卵丘扩张和纺锤体畸形、干扰微管动力学，影响猪卵母细胞正常发育[29]，在公猪上DON能导致猪睾丸支持细胞线粒体膜电位极显著下降(P<0.01)，并扰乱细胞周期，使细胞停留在G2期，导致睾丸支持细胞凋亡[30]，从而影响种畜禽动物的繁殖性能。

2.3 神经毒性

DON具有神经毒性，会导致动物产生厌食及呕吐反应。DON可以穿过血脑屏障到达大脑，促进大脑内部血清素含量的升高，干扰脑干最后区的调控功能[31]，诱导动物产生味觉厌恶，从而使得动物产生拒食甚至呕吐的行为[32]。不同动物受DON产生的厌食影响差异较大，影响从大到小依次为猪、小鼠、大鼠、家禽和反刍动物[33]。DON还能刺激大脑各区域组织，导致大脑发生病变，影响雏鸡脑部的脂质过氧化水平，从而扰乱钙稳态的平衡以及神经递质分泌[34]。同样，朱雷等[31]研究发现，DON能使仔猪脑组织中Ca2+含量以及5-羟色胺(5-HT)显著增加，同时使乙酰胆碱及多巴胺的含量显著下降，还能使小脑组织中钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ基因(CaMKⅡ)及钙调蛋白基因(CaM)表达降低，降低CaM蛋白表达水平，说明DON可影响神经递质分泌，对断奶仔猪产生有一定的神经毒性作用。

2.4 免疫毒性

DON对多种免疫细胞具有毒性作用，主要体现在对免疫细胞增殖的抑制现象、对免疫相关的细胞因子的影响以及启动免疫细胞凋亡的程序等。研究表明，DON可以抑制动物的免疫机能，诱导小鼠小肠黏膜和胸腺的T、B淋巴细胞发生凋亡，降低γ干扰素(IFN-γ)和转化生长因子-β(TGF-β)的表达，抑制动物体内淋巴细胞的增殖。张娅菲等[35]研究表明，DON能使仔猪血清补体3(C3)及补体4(C4)、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量均显著降低(P<0.05)，且小肠各段肠黏膜中免疫球蛋白表达水平随DON含量的增加而显著降低(P<0.05)，表明DON可降低断奶仔猪的肠道黏膜免疫及体液免疫水平，进而改变仔猪的免疫功能。刘双双等[36]研究表明，DON在终浓度为0.5、1、2 μmol/L时均极显著地降低了刀豆球蛋白A(ConA)介导的T细胞的相对活性和CD25、CD71的表达水平(P<0.01)，且呈剂量效应关系，表明DON对动物机体产生免疫抑制作用，与其抑制T淋巴细胞的活化有关[37]。

3 呕吐毒素防治措施

3.1 预防田间呕吐毒素的产生

为了预防DON对谷物的污染，应防止其在田间的产生和累积，同时在谷物收割后保持良好的运输及储存条件[38]。选择具有毒素抗性的作物品种、加强种植环节的管理、注意收获时的天气情况等也能有效减少谷物DON的积累。还可以通过对土壤进行深耕的方式对秸秆进行深埋处理，减少残留于土地表面的霉菌数量，为来年的种植提供相对安全的土壤环境。此外，张升等[39]通过研究发现，不同氮源对禾谷镰刀菌产DON毒素的作用差异较大，赖氨酸、酪氨酸作为氮源对禾谷镰刀菌产DON毒素的促进作用显著强于硝态氮(P<0.05)，缬氨酸、蛋氨酸弱于硝态氮。使用生物杀虫剂四霉素能显著降低小麦赤霉病指数和DON积累水平，并且与美康唑表现出协同作用[40]。因此选择合适的氮肥、农药也有助于减少田间DON的产生。

3.2 物理脱毒

通过水洗、脱壳加工、机械挑除、高温灭菌、吸附等物理方式均能对霉菌毒素产生一定的清除效果。小麦中的DON主要分布于麸皮，其含量高于芯粉，通过去皮加工可去除部分DON[41]。孙宝胜[42]研究发现，DON与小麦不完善粒及赤霉病粒之间存在显著正相关性。当前饲料行业广泛使用的机械挑除法，可通过色选的方式剔除被DON污染较重的不成熟玉米粒和破碎玉米粒[43]。蒙脱石(硅铝酸盐)是一类常用的霉菌毒素吸附剂，其硅氧四面体和铝氧八面体通过共用氧联结形成的含氧酸盐矿物质具有较强的离子极性，加上范德华力，对同样具有离子极性的霉菌毒素具有较为良好的吸附效应，但这类吸附剂对玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1吸附效果较好，对DON吸附效果欠佳，并会吸附饲料中的维生素等营养成分。然而，经过改性处理的蒙脱石可以极显著提高对DON的吸附率[44]。酵母细胞壁也是一种常见的霉菌毒素吸附剂，主要由甘露聚糖和β-葡聚糖通过离子键、氢键和疏水作用力与霉菌毒素结合起到吸附作用。虽然酵母细胞壁对DON的吸附效率较低，但能够缓解DON对猪生长性能的负面影响[45]。乳酸菌细胞表面具有疏水性，可通过细胞壁多糖、肽聚糖和磷壁酸对DON产生吸附作用，据报道，某些乳酸菌对DON的吸附效率为10%～55%[46]，并能在一定程度上缓解由DON引起的肉鸡肝脏毒性和肝脏损伤[47]。

3.3 化学脱毒

对霉菌毒素的化学脱毒主要集中于强酸、强碱处理法，或使用某些化学制剂如氨水、臭氧等。霉菌毒素对弱酸具有抵抗性，但在碱性环境下，其内酯环结构发生改变，从而使其毒性下降。氢氧化钠(NaOH)和氨(NH3)是食品工业中常用的碱，在室温条件下，发霉小麦在NaOH和NH3中分别处理1 h和18 h后，DON浓度分别降低了9%和85%[48]。臭氧能够攻击单端孢霉烯族毒素的双键，与DON的功能性基团发生化学反应从而达到脱毒目的[49]，且反应产物为氧气，不会产生有害残留物，对环境无不良影响。任东亮[50]研究发现在用14 g/m3浓度臭氧气体处理180 min后，小麦麸皮中DON降解率可以达到76.23%；臭氧对溶液中的DON降解率更高，在用10.84 g/m3浓度臭氧气体处理9 min后，溶液中DON降解率可达到98.30%。化学脱毒法虽能在一定程度上降解DON，但在脱毒过程中难以避免地的产生化学物质的残留，并降低饲料营养价值，因而限制了该方法在饲料生产中的应用[51]。

3.4 生物脱毒

生物脱毒主要是利用微生物产生的酶对霉菌毒素进行降解，或者是通过菌体自身的吸附作用并结合其代谢产物对霉菌毒素进行脱毒处理[52]。这种脱毒方法能够防止被破坏的霉菌毒素在动物肠道内进行二次释放，同时也能避免动物肠道内霉菌毒素随排泄物进入自然环境，起到保护环境的作用[53]。Yu等[54]从鸡肠道中分离出10株菌，它们可将DON转化成为毒性更低的脱环氧呕吐毒素(DOM-1)。田祖光等[55]从小麦土壤中筛选出一株暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)，其上清液中的活性物质对DON的降解能力可达到84.6%，相对于已报道的多株DON降解菌株，该菌降解效率达到较高水平。Eliana等[56]发现米根霉和米曲霉能利用过氧化物酶活性来降解DON。进年来，伴随着基因工程技术的发展，研究人员针对不同种类霉菌毒素的主要功能基团，培育出一系列专用的酶，以单端孢霉烯族毒素为例，氯酶可以通过破坏环氯基团、环氧基酶可以通过破坏C12和C13位点上的环氧化物，起到降低其毒性作用[57]。热休克蛋白70(Hsp70)已被证实具有分子伴侣功能，可提高细胞对应激原的耐受性、减轻细胞过氧化、抗细胞凋亡等功能[58]，董永芳等[59]研究发现，呕吐毒素脱毒菌(sp.WJ106)可以调节Hsp70蛋白的异常表达，能在一定程度上缓解DON对猪肠道损伤和生产性能下降的影响。

3.5 抗氧化解毒

大量研究发现，抗氧化剂能在一定程度上缓解DON产生的影响。白藜芦醇作为一种天然抗氧化剂，可有效缓解DON对猪肠道上皮细胞产生的细胞毒性和损伤作用[60]。谷氨酰胺(Gln)也具有抗氧化功能，能够促进谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)基因的表达，还能抑制一氧化氮的合成速率，调节信号传导过程中细胞凋亡酶的活性，并参与抗氧化物质谷胱甘肽的合成和由TNF-α诱导的细胞毒性作用[61]。研究发现，Gln还可以降低IPEC-J2细胞由DON导致的过量ROS，这可能是由于谷胱甘肽促进了GSH-Px的合成，提高了细胞抗氧化能力，清除过量的氧自由基，从而缓解了由 DON 引起的细胞损伤。氯喹(CQ)是一种抗疟疾药物，具有明显的抗氧化功能[62]，能显著提高血浆谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px活性和总抗氧化能力(T-AOC)，并能缓解DON造成的仔猪生长抑制作用，表明CQ抑制自噬能提高机体抗氧化酶活性和抗氧化能力，起到缓解DON诱导的氧化应激作用[63]。研究发现，鱼皮明胶酶解物能促进核转录因子相关因子2(Nrf2)的表达，并能促进Nrf2进入细胞核内，从而提高细胞内抗氧化酶的表达，有效降低活性氧水平，从而起到抑制DON诱导的氧化损伤。童雅琪[20]进一步研究发现，酵母活性肽可以激活机体抗氧化调节机制，调节胞浆肌动蛋白伴侣分子-核转录相关因子E2(Keap1-Nrf2)信号通路下游抗氧化相关蛋白的表达，缓解DON导致的猪肠道上皮细胞毒性损伤。朱雷[64]研究发现，N-乙酰半胱氨酸可显著降低ZEA与DON对仔猪睾丸支持细胞的细胞器造成的损伤，极显著降低MDA、ROS的表达量(P<0.01)，并极显著降低睾丸支持细胞的凋亡率(P<0.01)。

4 小结

随着各种饲料原料价格的攀升，粮食副产物被大量使用，尤其是小麦、玉米价格持续倒挂，大量小麦、小麦混合物用于饲料，造成DON污染范围、程度不断扩大，使饲料中DON含量大幅增长。近年来，国内外学者对DON的脱毒方法进行了大量研究，各种脱毒方法也得到了广泛的应用。但还需进一步研究和了解相关的脱毒机制，为DON脱毒产品的研发和畜禽健康养殖提供理论和实践依据。