EBV miRNAs介导T细胞体内免疫的研究进展

2022-11-25林梦瑶

临床与实验病理学杂志 2022年5期

林梦瑶，张声

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)属于人类疱疹病毒4型，多数人易感并表现为无症状感染。1964年Epstein和Barr在培养的伯基特淋巴瘤细胞中发现EBV，可引起传染性单核细胞增多症、淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等疾病。EBV进入人体，最初感染口咽部上皮细胞，经病毒外膜糖蛋白gp350/220与B细胞表面CD21分子结合，随后gp42/gH/gL/gB使病毒潜伏于B淋巴细胞中[1]。EBV通过病毒复制持续存在于感染个体中，并影响免疫应答过程，参与病毒感染的模式识别受体(pattern-recognition receptor, PRR)，调控固有免疫反应；在潜伏期和裂解期，抑制病毒蛋白的水平，从而降低免疫识别能力；利用非编码RNA如EBER、miRNA等多个靶点逃避宿主免疫攻击[2]。

在EBV基因组中，已鉴定出超过80个编码蛋白的开放阅读框(ORFs)以及大约30种不同的ncRNA，位于EBV BHRF1和BART区域的25个前体miRNAs编码至少44种miRNA[3]。 miRNAs改变病毒和宿主基因的表达，调控机体的免疫能力，参与免疫逃逸、细胞增殖、凋亡和代谢等过程[4]。T细胞参与机体免疫自稳，识别抗原并维持记忆和自我耐受，在抗感染和抗肿瘤中起至关重要的作用[5]，但miRNAs如何影响T细胞免疫的机制尚不明确。本文对近年EBV miRNAs介导T细胞体内免疫的研究进展进行综述，为进一步探讨发病机制提供依据。

1 T细胞发育

T细胞起源于骨髓祖细胞的造血干细胞，在皮质-髓质交界处T细胞祖细胞进入胸腺，发育为早期T细胞祖细胞，随后迁移至胸腺皮质，形成表达T细胞抗原受体(TCR)的CD4、CD8双阳性胸腺细胞，经历阳性与阴性选择后成为成熟T细胞，随血液输送到外周系统[5]。

2 EBV miRNAs调控T细胞免疫应答

2.1 EBV miRNAs减弱T细胞特异性识别抗原的能力EBV进入人体后，B细胞和T细胞是主要的免疫细胞，其中抗原提呈细胞(APC)将病原体抗原递呈给T细胞，T细胞通过免疫突触及双重识别辨认病原体抗原，CD4+T细胞和CD8+T细胞是参与适应性免疫应答的关键组分。CD4+T细胞介导溶酶体途径(MHC Ⅱ类分子途径，外源性抗原提呈)，APC摄取外源性抗原后，溶酶体降解抗原并与MHC Ⅱ类分子结合，供CD4+T细胞识别。CD8+T细胞介导胞质溶胶途径(MHC I类分子途径，内源性抗原提呈)，蛋白酶体降解内源性抗原，与MHC I类分子结合，供CD8+T细胞识别。

EBV miRNAs影响CD4+T细胞的抗原呈递。miRNAs靶向CD4+T细胞应答中信号通路病毒产物的表达，关键调控物质为白介素-12亚基(IL-12B)和溶酶体蛋白酶，如豆类蛋白酶(LGMN：编码天冬酰胺肽链内切酶AFP-豆荚蛋白)、组织蛋白酶B(CTSB)和干扰素γ诱导蛋白30(IFI30：编码IFN调节的硫醇还原酶GILT)[6]，减少IL-12、HLA Ⅱ类分子以及溶酶体酶的分泌[7]。荧光素酶报告基因检测发现miR-BART1、miR-BART2和miR-BHRF1-2通过3′UTRs调控IFI30、LGMN和CTSB的水平[8]。miRNAs影响CD8+T细胞识别抗原，通过降低细胞表面病毒抗原或肿瘤抗原递呈的MHC I类分子，协助肿瘤细胞逃避细胞毒性T细胞的杀伤[8-9]。抗原加工相关转运体(TAP)下调，抑制抗原肽与MHC分子结合形成pMHC，阻断抗原肽向内质网运输，减弱CD8+T细胞识别抗原及免疫应答的能力。

此外，EBV miRNAs能够降低病毒抗原的表达，间接阻止T细胞特异性识别抗原。EBV有6个核抗原(EBNAs)和3个潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)。如树突状细胞携带的LMP2A可以引起特异性免疫应答，以诱导CD8+T细胞依赖性免疫[10]，并影响MHC I类和MHC Ⅱ类分子途径交叉提呈处理抗原[11]。miR-BHRF1-3靶向IFN介导的趋化因子CXCL-11/I-TAC的表达，减弱T细胞识别抗原的能力[12]。

2.2 EBV miRNAs降低T细胞活化、增殖与分化的水平T细胞经过活化、增殖和分化后参与机体免疫应答。根据表面标志物可以将T细胞分为γδT细胞和αβT细胞，αβT细胞由CD8+T细胞、CD4+T细胞和NKT细胞组成；CD4+T细胞继续分化为Th1、Th2、Th9、Th17细胞等。

双识别信号(抗原识别、共刺激)和细胞因子是T细胞活化的重要途径，其中细胞因子是关键因素。如机体感染使树突状细胞分泌IFNγ和IL-12，促进T细胞增殖、分化为Th1细胞，该细胞表达转录因子T-bet，随后产生IFN，促进Th1细胞的分化；IL-4激活STAT6信号，诱导T细胞形成Th2细胞，并拮抗Th1细胞分化；GATA-3是主要的调节转录因子；IL-17促使T细胞向Th17细胞分化，参与炎症反应。

EBV miRNAs调节细胞因子影响T细胞活化、增殖与分化。研究表明，miRNAs参与多个免疫通路，下调与CD4+T细胞相互作用的关键分子。EBV+细胞高表达IL-12水平，支持免疫细胞信号的传递[13]。在体内IL-1β、IL-18和IL-12共同作用生成IFNγ，刺激T细胞向Th1和Th17分化和免疫应答，miR-BHRF1-2-5p阻止IL-1的信号通路，改变EBV相关性癌细胞中IL-1A和IL-1B的含量，间接干扰其他细胞因子的形成[14]。

2.3 EBV miRNAs阻止T细胞发挥效应初始T细胞遇到树突状细胞递呈的抗原和共刺激配体，增殖分化为效应T细胞清除病原体。其中CD8+效应T细胞通过诱导细胞凋亡和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，CD4+T细胞分化其他亚群进行免疫防御[15]，也能分泌细胞因子促进巨噬细胞的防御能力。清除病原体后，部分效应T细胞形成记忆T细胞。

CD8+T细胞经过次级淋巴器官循环，并通过TCR受体被树突状细胞激活，增殖分化的细胞毒性T细胞杀伤坏死和恶性细胞，防止机体感染和肿瘤形成[16]。研究发现，感染KSHV和EBV的B细胞可以将病毒编码的miRNA转移至T细胞，并抑制抗病毒反应[17]。记忆CD8+T细胞是抵抗病原体的主要成分，协同颗粒酶、穿孔素及细胞因子(如干扰素IFNγ、肿瘤坏死因子TNFα)介导杀伤效应[18]。

3 T细胞免疫与EBV相关性疾病的发生、发展

3.1 慢性活动性EBV感染其是由EBV引起的淋巴组织增殖性疾病，常见于东亚儿童和年轻人，临床表现为发热、肝脾和淋巴结肿大。实验室检查通常无特异性，外周血或受累器官中EBV-DNA水平升高是典型特征[19]。

目前，慢性活动性EBV感染发病机制尚不清楚，以往研究认为其与免疫系统异常和基因缺陷有关。Toyabe等[20]在慢性活动性EBV感染患者外周血中发现，抗原的免疫反应和EBV感染性T细胞的增殖是导致T细胞增高的原因。Fujiwara等[21]认为EBV感染的T/NK细胞中，常不表达特异性细胞毒性T淋巴细胞识别的免疫蛋白，如EBNA2和EBNA3s。相反，EBV永生化B细胞表达所有的潜伏蛋白。因此，EBV感染的T/NK细胞更易逃避免疫监视。此外，Onozawa等[22]研究发现慢性活动性EBV感染患者外周血单个核细胞中EBV感染的克隆增殖性T/NK细胞STAT3激活，并且JAK1和JAK2抑制剂鲁索替尼(ruxolitinib)抑制STAT3的磷酸化及炎症反应，同时降低EBV+T/NK细胞和外周血单个核细胞的活细胞数。Rodriguez等[23]发现慢性活动性EBV感染者出现PIK3CD和TNFRSF9纯合子突变，维持EBV感染T细胞的积累，TNFRSF9基因突变导致CD137/4-1BB表达完全缺失，减弱T细胞表达的共刺激信号；编码PI3K催化亚基p110δ的PIK3CD基因突变，降低激酶活性，减少T细胞的AKT信号。

有学者发现miRNA影响疾病发展。Kawano等[24]检测19例慢性活动性EBV感染者、14例传染性单核细胞增多症和11例健康对照组的12个miRNA血浆表达水平，发现慢性活动性EBV感染者血浆中特异性EBV miRNAs水平不同程度升高。一些EBV miRNAs，特别是miR-BART2-5p、13和15，是疾病严重程度或预后的潜在生物学标志物。Zhang等[25]构建EBV编码miRNAs的综合表达谱，结果显示慢性活动性EBV感染、EB病毒噬血相关综合征和鼻咽癌患者中miR-BART19-3p表达上调，慢性活动性EBV感染样本中APC mRNA表达与miR-BART19-3p呈负相关。

3.2 传染性单核细胞增多症其是由EBV感染的良性淋巴增生性疾病，常见于儿童和青少年，表现为咽喉疼痛、发热、肝脾和淋巴结肿大。

Kaul等[26]对CD8+T细胞、NK细胞、单核细胞和B细胞的基因表达谱分析发现，在急性感染期，CD8+T细胞和单核细胞的关键基因群(I型IRGs、Ⅱ型IRGs、细胞周期/代谢基因)表达上调。Barros等[27]发现在传染性单核细胞增多症中绝大多数的EBV+细胞是B细胞，CD8+T细胞多于CD4+T细胞，EBER+、PD-L1+细胞的数量与EBER+、CD3+和EBER+、CD8+T细胞的数量直接相关，提示PD-L1是T细胞感染EBV的机制。另外，EBV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞反应主要针对溶解蛋白，这些蛋白在感染急性期大量表达。急性期之后，记忆CD27+T细胞仍然存在，而效应CD27-T细胞的比例下降，当EBV重新感染时，记忆CD8+T细胞发挥最重要的作用[28]。

miRNA是调控机体免疫的关键因素。Gao等[29]检测15例传染性单核细胞增多症患儿的病毒和细胞miRNAs水平，发现早期传染性单核细胞增多症患者EBV-miR-BHRF1-1、1-2-3P,miR-BART13-1、19-3p、11-3P、12-1、16-1明显高于健康儿童，CD8+T细胞中hsa-miR-223、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-181a、hsa-miR-200a-3p、miR-155-5p、miR-155-146a、miR-155-142-5p等大部分miRNAs表达下调；随着疾病的进展，CD8+T细胞的大部分miRNAs，包括hsa-let-7a-5p、hsa-let-142-3p、hsa-let-142-5p和hsa-let-155-5p表达降低。Hu等[30]分析30例传染性单核细胞增多症患儿和10例健康儿童外周血淋巴细胞亚群miR-BART16及其靶蛋白的表达，发现传染性单核细胞增多症患儿血清中miR-BART16表达明显高于健康患儿，且与EBV拷贝数呈正相关。

3.3 EBV相关性胃癌其约占胃癌总数的10%，与EBV非相关性胃癌相比，EBV相关性胃癌的患者发病年龄较低，早期癌症发生率高，多见于男性，病变好发于胃上部或中部，主要累及黏膜下层，镜下见间质有高度浸润的淋巴细胞，预后较好[31]。

EBV相关性肿瘤中，MHC的下调或增加PD-L1和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达能使T细胞的监视功能失活[32]。EBV相关性胃癌常表现为ARID1A突变(55%)、BCOR突变(23%)、PIK3CA突变(68%)、DNA高甲基化、JAK2、ERBB2、PD-L1以及PD-L2扩增和罕见的TP53突变[33]。Su等[34]通过CRISPR-Cas9技术形成PD-1缺陷的细胞毒性T细胞，该细胞可以增强对EBV-LMP2A抗原的免疫应答，并且加大对肿瘤细胞的杀伤效应，对EBV相关性胃癌小鼠放疗后，PD-1缺陷型细胞毒性T细胞的抗肿瘤效应大幅增加，提示PD-1/PD-L1通路是T细胞杀伤病原体和肿瘤发展的重要途径。Chan等[35]发现，miR-BART5-5p直接靶向PIAS3的3′UTR，下调PIAS3蛋白水平、激活STAT3、增强PD-L1的表达。Sasaki等[36]发现经过JAK2、PI3K和mTOR抑制剂处理EBV相关性胃癌细胞后，PD-L1的表达水平降低到与未受IFNγ刺激细胞相同的水平，EBV相关性胃癌细胞表达高水平的PD-L1抑制T细胞增殖，IFNγ信号通路参与PD-L1的表达。Song等[37]在胃癌组织和细胞系中，发现上调miR-BART11可导致叉头盒蛋白P1(FOXP1)下调，可能触发癌细胞分泌IL-1β、IL-6、1L-10，导致胃癌患者生存期降低。

3.4 EBV相关性鼻咽癌鼻咽癌是鼻咽部上皮的恶性肿瘤，EBV感染是其中的危险因素，表现为鼻塞、涕中带血、复视、头痛，放疗效果较好。

MHC I类分子编码产物可以识别和递呈抗原给细胞毒性T细胞，MHC I类分子的突变和失活破坏抗原递呈机制，使EBV相关性鼻咽癌细胞逃离宿主免疫监视。EBV核抗原-1(EBNA-1)是机体感染的免疫识别位点，Fogg等[38]通过多肽和细胞因子刺激外周血单个核细胞，激活EBNA-1特异性CD8+T细胞的应答，发现该T细胞的免疫功能存在缺陷，从而促进鼻咽癌的发生、发展。Ye等[39]在鼻咽癌中发现外泌体miR-24-3p通过抑制FGF11表达，调节ERK和STAT蛋白的磷酸化，从而抑制T细胞的增殖和分化，调控癌细胞的生长。