非酒精性脂肪性肝病体外模型的研究进展

卢晓臣， 韩红梅

延边大学附属医院 消化内科， 吉林 延吉 133000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是在无过量饮酒的情况下出现肝脂肪堆积，并且至少5%的肝细胞存在脂肪变性[1-2]，其疾病谱包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化以及肝细胞癌[3]。最近研究[4]发现，高达30%的NAFL患者可发展为NASH。而且成人中NAFLD的全球患病率约25%[5]，在一些国家已成为肝移植最常见的原因[6]。然而，目前仍无针对NAFLD的特异性药物。在发病机制方面最受认可的是“多次打击”学说[7]，NAFLD体外和体内模型在相关研究中发挥重要作用。本文将NAFLD体外模型的研究进展总结如下，主要从细胞系和培养方式两方面阐述。

1 不同细胞系在NAFLD体外模型中的应用

1.1 原代细胞

原代细胞是使用两步胶原酶灌注或利用磁性细胞分离技术从切除的肝组织中分离出来的细胞。原代细胞在很短的时间内可保持其来源的形态和功能特征，然而其生命和扩增能力有限，不适于研究长期培养。

1.1.1 人原代肝细胞(primary human hepatocyte, PHH) PHH是直接从人肝组织中分离获得的，最接近体内肝细胞表型[8]。Huang等[9]将PHH暴露于15 μg/mL棕榈酸中48 h，建立NAFLD细胞模型后，用文蛤寡肽处理24 h，发现文蛤寡肽通过提高超氧化物歧化酶活性，发挥抗氧化应激作用，同时文蛤寡肽通过减少磷酸化氨基末端蛋白激酶和促凋亡蛋白基因Bax表达，降低半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3活性，发挥抗凋亡作用。正常肝组织在临床实践中很难获得，需要伦理授权，并且其分离和培养比较复杂。虽然目前PHH已被产品化，易购买，然而PHH具有供体之间的遗传变异以及表型不稳定问题，可能引起偏差，导致研究缺乏可重复性[10-11]。因此，PHH似乎特别适用于不需要长时间培养的药物代谢研究，在较小程度上适用于NAFLD的建模。

1.1.2 啮齿动物原代肝细胞 啮齿动物的原代肝细胞广泛用于研究肝内甘油三酯 (TG)代谢的过程，尤其是酯化过程及如何影响脂肪酸进入氧化途径，以及可能影响肝内TG通过极低密度脂蛋白输出的因素。啮齿动物的原代肝细胞与PHH相比更易获得，但是仅能部分复制人类的NAFLD模型[12]。Ju等[13]对雄性C57BL/6小鼠的肝门静脉内灌注汉克斯氏平衡盐溶液后分离出肝组织，然后用含胶原酶(Ⅰ和Ⅳ型)的DMEM培养基进行培养，离心获得小鼠原代肝细胞。将获得的小鼠原代肝细胞以及用富含半胱氨酸61 蛋白(cysteine-rich protein 61，Cyr61或CCN1)干预后的小鼠原代肝细胞，暴露于0.5 mmol/L的游离脂肪酸(free fat acid，FFA)(油酸∶棕榈酸=2∶1)中培养24 h，成功诱导建立NAFLD细胞模型，发现CCN1增加了小鼠原代细胞内TG水平，增加了TNFα、单核细胞趋化蛋白1、凋亡相关蛋白水平，同时也提高了半胱天冬酶-3和促凋亡蛋白基因Bax的表达水平，提示CCN1促进了NAFLD的进展。另有研究[14]利用24～32 d的雌性C57BL6J小鼠获得原代肝细胞，然后将原代肝细胞加入含有棕榈酸浓度梯度为0～0.1 mmol/L的培养基中培养24 h，发现0.02 mmol/L棕榈酸培养的肝细胞具有最高的细胞活力和脂肪积累率，并发现补骨脂可通过抑制蛋白激酶C/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐氧化酶信号途径减轻棕榈酸诱导的小鼠原代肝细胞脂肪变性。

1.2 传代细胞

在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。传代细胞显示出比原代细胞更高的复制能力和稳定的表型，具有高可用性、易于处理和无限的使用寿命的优点，成为有吸引力的造模细胞，然而其在传代过程中，一些细胞会发生形态学改变，导致难以培养，从而限制了其应用[15]。以下介绍几个常用的传代细胞。

1.2.1 HepG2细胞 HepG2细胞是来源于肝母细胞瘤的一种上皮细胞，并保留了肝实质细胞的几种生化功能，不仅易于处理，而且有无限的使用寿命。因此，HepG2细胞已成为有吸引力的模型细胞。制备NAFLD细胞模型时，通常用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，多采用油酸、油酸和棕榈酸、脂肪乳剂以及引起脂质堆积的培养液等诱导。这可导致细胞内TG水平升高105%～1100%，在油红O染色下可观察到细胞内大量脂滴积累、胞质内充满大量大小不一的橘红色脂滴、细胞内线粒体数量较少、内嵴数量减少、脂滴形态学变化极为明显[16]。因此，HepG2细胞曾一度作为在NAFLD细胞模型研究中最常用的细胞。然而，HepG2细胞毕竟来源于肿瘤细胞，与正常肝细胞相比，两者的生理条件存在很大差异，而且肿瘤细胞代谢较快，导致药物作用的时间太短，而无法观察到药效。因此，目前HepG2细胞主要用于NAFLD脂质代谢研究。

1.2.2 HuH7细胞 HuH7细胞来源于高分化的肝细胞癌，具有无限的生长潜力，而且在整个培养时间内均具有稳定的表型。HuH7细胞和HepG2细胞具有相似的缺点，目前也是主要用于NAFLD脂质代谢研究。

1.2.3 HepaRG细胞 源自人类肝细胞癌的HepaRG细胞具有一些肝祖细胞的特征和特性(可以转分化为肝细胞和胆管细胞)。HepaRG细胞表达各种酶和受体(如组成性雄甾烷受体、孕烷X 受体、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶等)，并且在功能蛋白表达上不逊于PHH，因此HepaRG细胞已被推荐用于药物代谢和毒性研究[17]，是研究NAFLD药物开发方面具有潜力和优势的细胞系。

1.2.4 LO2细胞 LO2细胞是永生化的人正常肝细胞，具有正常肝细胞的生物学特性和肝功能，通过诱导构建的高脂细胞模型，能建立一种接近于临床的NAFL或NASH肝细胞模型，与HepG2细胞相比，LO2细胞更适于NAFLD细胞筛药模型研究。LO2细胞通常用含10%胎牛血清的1640培养液培养，多采用油酸、胎牛血清、油酸和棕榈酸、脂肪乳等，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，诱导并成功建立细胞模型后，细胞内TG水平升高32%～428%，油红O染色观察到细胞明显增大，细胞内有较多较大的红色脂肪滴，甚至出现脂肪滴的融合现象，趋向于大泡性脂肪样变，细胞内脂滴形态学变化极为明显[16]。近几年LO2细胞常用于建立NAFLD细胞模型。

1.3 肝细胞样细胞(hepatocyte-like cell，HLC) HLC是由人类干细胞分化而来的细胞，包括肝干细胞和胚胎多能干细胞[18]。人类干细胞在生长因子和营养物质的联合培养下可在体外分化为HLC[19]。Deepak等[20]采用葡萄糖摄取法测定HLC的功能，并与PHH进行比较，结果发现在两种细胞类型中，葡萄糖的摄取量大致相同，提示HLC的功能类似于PHH。进一步实验采用油酸和棕榈酸(75 μmol/L∶25 μmol/L)的脂质混合物处理HLC 24 h，建立了体外NAFL模型，发现与NAFL进展相关的基因如水通道蛋白1、Ⅲ型胶原蛋白α1和Ⅰ型胶原蛋白α1基因表达增加，这些基因已被证实为NAFLD疾病进展的生物标志物[21]。另一项研究[22]将HLC加入含有乳酸钠、丙酮酸钠和辛酸(10 mmol/L∶1 mmol/L∶2 mmol/L)的培养基中培养48 h，发现NASH线粒体功能障碍相关的转录产物(如细胞死亡活化蛋白抗体、醛酮还原酶AKR1C2和醛酮还原酶AKR1C4)含量减少及其相关的代谢产物酰基肉碱和肉碱代谢产物失调，这些表现与NASH早期患者中观察到的一致，该模型对研究已知遗传背景的NAFLD发病机制具有重要意义。HLC虽然不受培养时间的限制，具有与原代肝细胞相似的形态学和功能特征，但是HLC也具有胚胎干细胞的伦理问题、细胞分化不完全和缺乏标准化培养方案等缺点，从而一定程度上限制了相关研究的可重复性[11]。

2 不同培养方式的NAFLD体外模型

2.1 二维细胞培养模型

2.1.1 二维单细胞培养模型 目前为止，大多数体外研究都利用二维单层肝细胞培养来阐明NAFL所涉及的分子机制。二维单层肝细胞培养技术的优点是培养方法足够成熟，选择各种细胞和培养方法较为简单，然而不能长时间(通常为12～48 h)进行细胞培养，未能研究TG长期积累导致的变化，更为重要的是二维单层细胞培养不仅不能代表人类组织的复杂性，还缺乏关键的肝细胞-非实质细胞相互作用[23]。

2.1.2 二维共同培养细胞模型 在体内肝组织的复杂结构中，两个或多个细胞的相互作用是一种普遍现象，而且肝脏中的非实质性细胞如Kupffer细胞和肝星状细胞在肝细胞的存活和功能中也起重要作用[24]。因此，迫切需要研究NAFLD进展过程中反映细胞间相互作用的体外模型。已有研究[25]表明，原代肝细胞与Kupffer细胞和肝星状细胞共同培养后，提高了肝细胞活力和功能。Barbero-Becerra等[26]将LX-2肝星状细胞细胞单独培养或HuH7肝细胞和LX-2肝星状细胞共同培养于1200 μmol/L浓度的FFA(棕榈酸和油酸之比为1∶2)的培养基中培养24 h，建立NAFLD模型，结果提示Huh7肝细胞与LX-2肝星状细胞共同培养时显著表达α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)，证明了肝星状细胞的激活需要细胞间的相互作用。Anfuso等[27]将LX-2肝星状细胞和Huh7肝细胞独立培养或共同培养(LX-2肝星状细胞和Huh7肝细胞之比为1∶5)，分别加入含有1200 μmol/L的FFA(油酸与棕榈酸之比为2∶1)培养基中96 h，建立NASH模型，然后加入5 μmol/L水飞蓟宾一起培养24、96和144 h，发现活性氧在共同培养模型中减少最明显，水飞蓟宾的抗氧化作用在共同培养中最明显，从而证明了肝细胞与肝星状细胞之间的串扰不仅体现在NASH的疾病进程中，而且在治疗NASH方面也具有重要意义。Jain等[28]将HepG2肝细胞和LX-2肝星状细胞(5∶1)共同培养于含有0.75 mmol/L棕榈酸的培养基中16 h，建立NASH细胞模型，评估了Saroglitazar、吡格列酮和非诺贝特的药物作用，发现Saroglitazar减轻线粒体功能障碍、NF-κB磷酸化和肝星状细胞的激活方面优于另外两种药物。二维共同培养细胞模型是将不同类型的细胞放在同一环境中一起培养，并且可以通过向培养基中添加FFA诱导脂肪变性。因此，二维共同培养细胞模型主要用于研究体外肝细胞与非实质细胞之间的相互作用，是研究细胞之间串扰的重要工具。但是缺点是很难实施，操作起来比较复杂。

2.2 三维细胞培养模型

2.2.1 三明治培养模型 为了克服部分单层培养中原代肝细胞功能和形态的迅速改变，研究人员[9]开发了三明治培养模型，即肝细胞放置于两层胶原蛋白凝胶之间，研究发现肝细胞至少能维持6周的糖原合成和储存、尿素生成、血浆蛋白合成和分泌、脂质代谢和转运、胆汁酸合成和重摄取，而肝细胞和胶原蛋白在单层培养时，则1～2周内停止这种分泌。最近开发了一种更复杂的三明治培养模型，模拟肝小叶结构，将肝细胞和肝窦内皮细胞在胶原蛋白凝胶中共同培养，通过肝细胞和肝窦内皮细胞之间的接触，增强了肝细胞的功能和存活率[29]。然而，在三明治培养模型中，由于胶原蛋白的厚度，细胞与细胞之间的相互作用可能被隐藏或阻塞，因此，三明治培养模型很少用于NAFLD模型[11]。

2.2.2 肝球体 肝球体是目前最常用的三维培养模型。球状体的形成是由肝细胞的自我聚集引起的，不需要非黏附表面和重力黏附等技术干预。Kozyra等[30]将肝球体(由PHH和少量的Kupffer细胞和星状细胞组成)与反映NAFLD患者肝脏体内环境的FFA、葡萄糖和胰岛素混合液中(浓度分别为320 μmol/L、5.5 mmol/L、0.1 nmol/L)共同培养3周，随后停止向培养基中加入其混合液，加入不同剂量的抗脂肪变性化合物(如二甲双胍、胰高血糖素、奥拉帕尼等)共同培养10 d，发现FFA、胰岛素和碳水化合物的混合液促进了肝细胞中脂质的积累，增加了脂肪合成基因(脂肪酸合酶)的表达；抗脂肪变性化合物降低了脂质含量，进一步证实了脂肪变性的可逆性。另有研究[31]将PHH、肝星状细胞、Kupffer细胞和内皮细胞组成的肝球体加入含有0.5 mmol/L棕榈酸的培养基(加入或不加入凋亡信号调节激酶-1抑制剂的情况下)中培养9 d，成功建立NASH模型，在此模型中，棕榈酸显著增加了α-SMA、基质金属蛋白酶1和血小板衍生生长因子受体β基因的表达，结果显示凋亡信号调节激酶-1抑制剂显著降低棕榈酸诱导的NASH的炎症反应和肝纤维化。Pingitore等[32]将肝球体(HepG2细胞和LX-2细胞之比为24∶1)加入含有500 μmol/L的FFA(棕榈酸和油酸之比为1∶2)中培养48 h，建立NASH细胞模型(脂质的积累、Ⅰ型胶原蛋白的水平升高和α-SMA的表达增多)，随后将球状体与利拉鲁肽或Elfibranor(治疗NASH的临床试验药物)一起培养48 h，发现利拉鲁肽或Elfibranor减轻了NASH表型。类似一些研究也是利用肝球体建立NASH模型，观察一些药物对NASH的疗效[33]。肝球体可以作为一种有价值的NAFLD体外模型，有助于发现新的药物靶点，可以成为合适的药物筛选模型。然而，实际操作时很难保持均匀的球体大小，并且会出现球状簇，限制球体对营养物质和氧的吸收，导致细胞死亡。

2.2.3 肝类器官 肝类器官是体外联合培养的具有细胞-细胞/细胞-基质相互作用的组织特异性细胞的集合，可概括体内肝脏的形态和功能特征。肝类器官与传统的细胞培养方法相比，具有明显的优势，即肝类器官可以更紧密地模拟自然生理过程，包括干细胞分化、细胞运动和细胞间相互作用。此外，肝类器官还可以进行广泛的扩增和培养，并保持其基因组学稳定性，从而可以长期保存[34]。Ouchi团队[35]采用不同浓度的油酸(200、400、800 μmol/L)处理多能干细胞衍生的肝类器官导致脂质积累，发现随着油酸浓度增加，脂质积累也会增加，当采用油酸培养肝类器官5 d后，观察到了NASH典型表现包括肝细胞的气球样变，IL-8、Ⅲ型前胶原氨基端原肽和α-SMA表达的上调以及胶原蛋白的沉积，随后加入法尼酯X受体激动剂FGF19药物2 d后，发现上述表现明显改善。Kruitwagen等[36]利用猫肝祖细胞衍生的猫肝类器官加入含有FFA(0.4 mmol/L油酸酯和0.2 mmol/L棕榈酸酯)的培养基中培养24 h，建立NAFLD模型；并有研究[37]发现T863(二酰基甘油酰基转移酶1 抑制剂)以及AICAR(AMPK激动剂)两种药物降低脂质蓄积，为评估这些药物用于NAFLD的临床应用奠定理论基础。Wang等[38]采用FFA诱导多能干细胞衍生的肝类器官建立了NASH细胞模型，表现为脂质积累，上调脂质代谢相关基因(载脂蛋白C2、肉毒碱棕榈酰基转移酶2和肉毒碱棕榈酰基转移酶1A)的表达，增加了活性氧、各种炎性标记物(IL-8、IL-6、TNFα、单核细胞趋化蛋白-1)和纤维化标志物(α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白)的水平。肝类器官源自患者组织活检或多能干细胞，可包含多种细胞类型，具有与原生肝器官类似的结构和功能，已成为研究肝生理学和病理生理学的新型体外工具，通常用于疾病建模和药物筛选。然而，肝类器官可能会出现细胞分化不完全，不包括肝脏中存在的所有细胞,仍无法表现出完整的肝功能以及血管化、免疫化、神经支配等[39]。

2.2.4 肝芯片 肝芯片是一种三维体外肝微生理系统，是模拟肝细胞状态和肝动态理化环境的高通量系统。肝芯片的微结构是由聚合物支架构成，该支架由数百个小通道组成。这样的结构使得当肝细胞被植入这些通道时，肝芯片中的聚合物支架会排列成长长的甜甜圈状，非常类似于肝小叶，而且将含有各种营养物质和氧气的微流体模拟血流。因此，肝芯片极大地增加了体外模拟NAFLD的可能性，是了解脂质代谢异常的重要方法。Gori等[40]利用FFA(0.33 mmol/L棕榈酸和0.66 mmol/L油酸)培养肝芯片(植入HepG2细胞)48 h，成功建立NAFL模型，该设备模拟了肝窦的内皮-实质界面，并允许营养成分的扩散和废物的清除，类似于肝脏的微循环，反映了NAFLD患者体内脂质积累过程。Lee等[41]研发了一种肠-肝芯片，并评价了α-硫辛酸、丁酸盐、TNFα对脂肪变性的影响，该芯片由肠侧胶原支架多孔膜隔开的两个腔室组成，Caco-2肠细胞植入肠腔，HepG2肝细胞植入肝腔，加入含有3.8 mmol/L浓度的FFA(油酸和棕榈酸之比为2∶1)的培养基中培养或其内分别加入α-硫辛酸、丁酸盐、TNFα(浓度分别为2 mmol/L、2 mmol/L、25 ng/ml)培养24 h，发现α-硫辛酸降低了芯片中TG积聚；丁酸盐通过增强肠屏障功能吗，减少肝细胞内脂质积累而减轻了脂肪变性；TNFα使Caco-2肠细胞的屏障功能受损，允许更多的FFA穿过屏障接触HepG2细胞，从而增加了HepG2细胞脂肪变性。Freag等[42]开发了一种肝芯片，其包含PHH、肝窦内皮细胞、Kupffer细胞和肝星状细胞，将该芯片培养于含有油酸、棕榈酸和脂多糖(浓度分别为0.66 mmol/L、0.33 mmol/L、10 μg/mL)的培养基或其培养基内加入Elafibranor药物(过氧化物酶激活α受体和δ受体激动剂)培养10 d，模型组表现出典型的NASH特征，包括细胞内脂质蓄积、肝细胞气球样变、肝星状细胞活化、炎性标志物(TNFα、巨噬细胞炎性蛋白1α和单核细胞趋化蛋白1)和纤维化标志物(α-SMA、金属蛋白酶组织抑制因子1和Ⅰ型胶原蛋白)的升高，Elafibranor干预组减少细胞内脂质约8倍，减少肝细胞气球样变约3倍，明显降低肝星状细胞活化、炎性和纤维化标志物水平，从而显著抑制了NASH进展。肝芯片与二维培养相比，通过其微流体动力学体现出更高的肝细胞活力、逐渐降低的细胞内脂质蓄积和较轻的氧化应激；与肝类器官相比，肝芯片有标准化协议和生物工程制造优势，具有更高的可重复性，然而肝芯片由于复杂度高和成本昂贵，并未得到广泛应用。

2.3 精密肝切片 精密肝切片(precision-cut liver slice，PCLS)是研究NAFLD机制方面的有效体外模型，PCLS维持了肝脏的细胞构成和组织结构，完整保留了肝药酶和细胞器的活性，也保留了细胞之间的连接及一定的细胞间质，因而更加接近体内生理条件。Palma等[43]将人PCLS培养于含有FFA(油酸和亚油酸浓度均为0.1 mmol/L)的培养基中培养24 h，模拟了NAFLD早期肝脂肪变性、脂质沉积和脂毒性。Prins等[44]将大鼠PCLS加入模拟代谢综合征的培养基中培养24 h，其含有葡萄糖、果糖、胰岛素和棕榈酸(浓度分别为25 mmol/L、5 mmol/L、1 nmol/L和240 μmol/L)，结果发现乙酰辅酶A羧化酶基因1和2的表达增加，肉碱棕榈酰转移酶1基因表达降低，表明早期脂肪变性是通过新生脂肪增加和线粒体β氧化减少而实现的。PCLS的主要局限是切片机价格昂贵，成本高、可重复性差、培养维持时间短和需要新鲜切除的肝组织等。

3 总结与展望

综上所述，本文总结了近几年常用的NAFLD体外模型及在研NAFLD体外模型，这些模型为研究者根据自身研究目的选择合适的细胞及培养条件提供帮助，为获得高质量研究成果提供保障。相信随着对NAFLD认识的不断深入和突破，将会出现更稳定、简单有效、与NAFLD发病相关的病理生理学模型来促进NAFLD发病机制及防治药物的研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：卢晓臣负责分析资料，撰写论文，修改论文；韩红梅负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。