整合素α5β1与α1β1参与调控膝骨关节炎发病机制的研究进展

★ 付阳阳 康知然 戴大城 龚利 房敏 孙武权（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院推拿科 上海 200437）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是老年人常见的退行性病变，临床表现为关节疼痛、绞锁、下肢功能障碍，严重者可伴有关节肿胀、肌肉萎缩等。据国内外初步调查，全世界KOA的患病率约为4%～13%［1］。在中国，调查发现40岁以上人群的患病率为10%～17%，60岁以上则达50%，而在75岁以上人群患病率高达80%［2］。KOA在中老年人中不仅有较高的患病率，且严重影响人们日常工作、生活，导致生活质量下降，且KOA高居全球致残因素第12名［3-4］，为家庭与社会都带来了较大的经济负担。随着研究进展，膝骨关节炎的发病机理主要与关节局部因素、全身因素及个体遗传因素有密切关系，而目前公认的机制当属关节软骨及软骨下骨受到直接或间接的压力和磨擦损伤，导致软骨细胞或基质受损、丢失，引发KOA。

整合素是由α、β亚单位组成的异质二聚体黏附糖蛋白受体。整合素可以调节软骨细胞与胶原、纤维连接蛋白、层黏连蛋白等细胞外基质（ECM）的结合，并在生长、分化、迁移和基质合成等过程中起着关键的信号转导作用［5］。早期研究发现，某些整合素的表达水平在膝骨关节炎的发病与进展过程中出现改变与成骨细胞、软骨细胞黏附、连接、调节细胞骨架及调控软骨细胞凋亡有关［6-8］。

为了深入探索整合素对于KOA发病及进展的调控机制，通过总结近10年来与膝关节炎的关联较为密切的整合素α5β1、α1β1相关的实验研究，从α5β1、α1β1整合素调控细胞外基质及细胞内信号转导等方面分析整合素在KOA发病机制中的调控作用与相关性，旨在为KOA发病机制的进一步探索提供新的思路与方向。

1 整合素的基本结构

从结构上看，整合素有α和β两条支链，在空间上两条长链平行并于胞外尾端汇合的倒置“U”字形结构。到目前为止已知的有16个α支链和8个β支链，共组成24种整合素［9］。α亚基与β亚基的功能有所不同，α亚基调控整合素与阳离子依赖性配体的识别，β亚基则调控胞内骨架的相互作用和胞内信号传导以及调节细胞的生物学功能［10］。

2 整合素α5β1参与调控KOA发病

2.1 整合素α5β1调控细胞外基质的信息转导

整合素α5β1是细胞外基质中纤维黏连蛋白（fibronectin，FN）的重要受体。其α5亚基可以识别FN分子中RGD序列(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)。Pulai J等［11］发现将人新鲜分离的软骨细胞置于低密度聚L-赖氨酸的无血清培养基中培养时死亡，但在含FN的培养基中显示存活率＞95%，且加入针对α5亚基的单克隆阻断抗体后发现软骨细胞在FN培养环境中的存活受到明显抑制。提示α5亚基是FN的特异性受体，其与FN结合后能够传导软骨细胞的存活信号，且两者结合阻断后会引起存活信号下调与软骨细胞凋亡。

在体外实验中，Inoue T等［12］将α5β1或RGD肽片段的抗体注射于大鼠胚胎的上肢部分后发现其比对照组大鼠的上肢生长速度缓慢，亦证实了整合素与FN结合对于软骨的成骨作用。因此，可推测α5和FN结合的环节受阻与破坏能够部分解释KOA中软骨细胞的损伤。

Maylin A B等［13］发现在以细胞外基质降解为主的骨关节炎中，软骨细胞基质的合成和降解平衡显著改变，而造成这种不平衡的原因之一是整合素α5β1与可溶性FN片段而不是不溶性FN连接，从而诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的表达。MMP-3是一种基质金属蛋白酶，属于参与降解Ⅱ型胶原的过程，也使与透明质酸相连的可聚蛋白多糖由于网络的松解而丢失，从而破坏关节软骨。研究者利用α5β1与FN结合缺陷的小鼠（col2acre；Fn1RGE/fl）与野生型小鼠进行对照，在5个月大时，通过中等机械负荷的强迫运动或高机械负荷的部分切除半月板强迫运动对膝关节施加压力。未训练对照组的缺陷小鼠的关节软骨正常，而暴露于高机械负荷组小鼠出现以蛋白多糖和Ⅱ型胶原丢失为特征的骨关节炎。发现Col2a-Cre；Fn1RGE/fl小鼠关节软骨关节炎的进展明显快于野生型小鼠。研究者同时观察到α5β1与FN结合缺陷小鼠的关节软骨中MMP-13和MMP-3金属蛋白酶的表达增加，严重影响了基质重塑。提示FN-α5β1黏附作为细胞外基质传感器在关节软骨再生情况下作用十分关键。

作为软骨细胞与细胞外基质结合的主要参与者，当有外力作用于软骨时，软骨细胞感受外在的应力刺激信号并通过整合素将外力信号转换为细胞信号并调节细胞行为与细胞外基质环境以适应外力负荷，此过程被称作机械转导［14］。其中，外力刺激信号经过细胞外基质到达整合素是整个机械转导的第一步。适量的应力刺激有利于软骨细胞的增殖与分化，但研究显示过量的外力刺激会造成反作用。张丽萍等［15］将小鼠进行伸直位固定制动法造模成KOA模型一定时间后观测小鼠β1-mRNA与β1蛋白的表达情况，发现模型组小鼠的β1-mRNA与β1蛋白的表达水平明显低于空白组。伸直位固定制动法增加了小鼠关节软骨的所受应力，引起小鼠关节生物力学的失衡，而整合素α5β1接收到这种失衡的力学信号后将β1亚基的表达下调，致使整合素调节细胞外基质与软骨细胞的信号传导能力减弱，最终导致软骨细胞死亡及细胞外基质的损伤。这提示了膝关节软骨承受过量的应力负荷将通过整合素调控导致KOA发病。

2.2 整合素α5β1调控细胞内的信息转导

整合素α5β1参与细胞内信号转导主要靠激活两种络氨酸依赖性通道而进行：黏着斑激酶（focaladhesion kinase，FAK）信号转导通路和Shc信号通路。FAK通道可以进而激活FAK-Ras-丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路、FAK-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路和FAK-转录因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路，少部分整合素可以激活SHc信号转导通路［16-17］。

FAK作为一种酪氨酸激酶，可分三个结构域：N2端区、激酶区和C2端区。整合素与FN结合，促进黏着斑（focal adhesion plaque，FAP）的形成，β1亚基的胞质端与FAK的N2端区结合，引起FAK构象的改变，使激酶结构域处于活化状态［18］。同时，FAK上的可磷酸化的络氨酸位点Tyr397自身磷酸化，进而激活MAPK通路、FAK-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路和FAK-STAT1通路，对细胞内基因表达活性、细胞黏附力等产生影响［19］。

Zhang Y等［20］对12周龄SD大鼠的半月板软骨细胞进行循环静水压力处理，结果发现处理后α5β1 mRNA和蛋白表达水平显著上调，且磷酸化黏着斑激酶（Pho-FAK）表达上调，提示FAK通道的激活，并观察到MAPK通路、PI3K通路产物Pho-PI3K、Pho-ERK1/2上调。半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，是细胞凋亡的过程中的重要物质。循环静水压处理后，同样观察到caspase-3下调。为论证磷酸化PI3K、磷酸化ERK1/2上调与caspase-3下调是否与整合素α5β1表达上调有关，研究者通过整合素α5β1抑制剂与特异性siRNA转染抑制整合素α5β1的表达，发现这些效应均可被消除。提示随着膝骨关节炎病情发生时，人体可能通过调控α5β1-FAK-PI3K/ERK的通路调节软骨细胞凋亡使半月板软骨细胞产生持续退变。

Birgit L等［21］对人体骨关节炎软骨施加拉伸应力后观测发现细胞外基质降解酶与白介素-6（IL-6）的含量显著降低，而负责调控这两者的α5β1-FAK-MAPK与 α5β1-FAK-STAT3通 路的磷酸化水平亦显著降低。提示膝骨关节炎的发生与上述两条通路的调控有关。

3 整合素α1β1参与调控KOA发病

3.1 整合素α1β1调控细胞外基质的信息转导

整合素α1β1作为一种主要的胶原蛋白受体，可以与细胞外基质中含量90%的II型胶原、富含的VI型胶原结合［22］。胶原的降解、损坏往往被视作KOA软骨损伤的病理基础之一。席小芳等［23］为研究KOA软骨细胞外基质Ⅱ型胶原的降解与整合素α1β1-盘状结构域受体2（discoidin domain receptor，DDR2）-MMP13通路间的表达的关系，将新西兰大白兔用Hulth-Telhag法制成KOA模型后，取其软骨细胞观测后发现模型组较之正常组的Ⅱ型胶原蛋白含量及活性表达均明显减少，而DDR2、MMP13活性及mRNA表达均明显增多。前文提到，MMP族系表达增加能够加速细胞外基质纤维网状结构的降解，而降解后的Ⅱ型胶原三螺旋结构裸露并与DDR2受体结合，促使DDR2发生酪氨酸磷酸化并启动一系列生物化学反应和OA病理变化。因此其反应出KOA病理的发生与α1β1表达引发MMP13与DDR2水平上调引发Ⅱ型胶原纤维降解有很大关系。

在骨关节炎软骨中，II型胶原经MMP-13降解后会发生从II型胶原到I型胶原的转换的现象［24-25］，在此背景下，Marie C R 等［26］为研究软骨细胞单独在Ⅰ型胶原纤维中是否有MMP13表达，将小鼠软骨细胞系列615（MC615）放置在只充满Ⅰ型胶原的培养皿中，观测后发现的确有MMP13的表达上调，同时，为了进一步验证整合素α1β1在MMP13与Ⅰ型胶原纤维之间的调控作用，加入了α1亚基与β1亚基的抗体，抑制了整合素功能后发现软骨细胞形态比未加整合素抗体时更加完整，因此证实了整合素α1β1可以通过调控MMP13表达上调来使胶原类型改变，稳定性降低，最终使软骨受损，从而形成KOA发生的病理基础。

3.2 整合素α1β1调控细胞内的信息转导

生长因子（growth factor，GF）是一种存在于细胞中刺激细胞生长活性的细胞因子。其通过与特异性高亲和性的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等效应的多肽类物质［27］。研究发现，整合素能够经细胞内调控不同的细胞因子表达来影响软骨细胞的损伤与保护。

表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，EGFR的抑制剂MIG-6能促进使EGFR受到抑制而引起自发性骨关节炎的早期发病［28］，但当EGFR过度表达后却会导致更严重的骨关节炎［29］。转移生长因 子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）被认为是一种参与组织损伤修复的生长因子。然而，TGF-β信号过度表达会导致小鼠膝关节软骨细胞生长过度，大量消耗原料与能量，使蛋白多糖耗竭，最终反而引起软骨损伤［30］。Sefat F等［30］为研究整合素α1β1是否对生长因子存在调控从而对创伤后骨关节炎产生保护作用，其通过观测α1基因缺失小鼠（α1-Null）小鼠与野生型（WT）小鼠软骨发现，在α1-null鼠中抑制EGFR信号能使其软骨损伤减少，而WT小鼠则无此现象，因此证明了整合素α1β1能够调控EGFR来使创伤后关节炎得到保护。同时他们还发现α1β1抑制TGF-β信号转导，α1-null小鼠软骨细胞钙瞬变反应发生与Smad2/3（将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用的蛋白）活化使TGF-β阈值比WT小鼠低10倍。本实验提示我们整合素α1β1能够调控EGFR与TGF-β的信号来影响KOA发展的进程

Parekh R等［31］为研究整合素α1β1对小鼠骨关节炎软骨中白介素-1（IL-1）和TGF-β1表达的影响，观测α1-Null小鼠与野生型小鼠，发现与野生型小鼠软骨细胞相比，α1-Null小鼠细胞中IL-1R2mRNA表达的基础水平降低，同时通过细胞内钙瞬变反应与Smad2/3激活增强了TGF-β1的应答。白介素有IL-1α与IL-1β两种亚型，与IL-1R1与IL-1R2两种受体相对应。α1-Null小鼠细胞中IL-1R2mRNA下调提示整合素α1β1可以通过改变IL受体表达水平来影响软骨细胞对IL-1的反应，进而影响骨关节炎进展。

另一些研究提示整合素α1β1可能通过其他信号通路调控KOA的发生。例如Mickiewicz B等［32］观察α1-null小鼠与野生型小鼠，发现与野生型小鼠相比，α1-null小鼠血清中二甲基砜、谷氨酰胺、5-羟色胺的水平更高。而5-羟色胺参与TRP通道的炎症介质调节，提示整合素α1β1可能与Trp通道家族成员之间存在相互作用从而影响KOA的炎症发展。

4 总结与讨论

整合素不仅家族庞大，存在于多种组织中，且参与的信号转导过程亦十分复杂。整合素α1β1、α5β1与膝关节软骨的关联度紧密，在KOA发病机制中它们具有一定的地位。通过对α1β1、α5β1在调控细胞外基质及细胞内信号转导的各实验的归纳总结，能够明确以下六点：（1）KOA的发生与α5亚基缺失或α5-FN结合受阻形成的软骨损伤有关。（2）KOA的产生与过量的应力刺激信号经α5β1转导后引起的软骨细胞死亡及细胞外基质损伤有关。（3）KOA的发生与进展可能与α5β1调控FAK-Ras-MAPK、FAK-PIK3、FAKSTAT以及SHc通路的信号转导来影响软骨细胞的存活、炎症反应有关。（4）KOA的发病与α1β1调控下的Ⅱ型胶原降解引起的细胞外基质的损伤有关。（5）KOA的发病可能是由于α1β1调控细胞因子及生长因子的表达水平而引起的炎症反应或细胞损伤、基质损伤有关。（6）KOA炎症的发展可能与α1β1可能与Trp通道家族成员之间的相互作用有关。

从上述所有研究来看，目前KOA相关的整合素研究有以下特点：（1）实验类型还是以动物实验为主，小鼠与家兔软骨是目前研究的主流对象。（2）对亚基的基因敲除/缺陷是主要的对整合素的干预方式。（3）细胞外基质的纤维蛋白、蛋白金属酶、生长因子及细胞因子的含量或表达水平是实验主要的评价指标。（4）实验设计思路统一为经典的“黑箱”式逻辑，即已知整合素能调控某一通路而使通路终点某产物产生变化，因此经条件干预后的产物出现增加/减少或水平上调/下调则能论证整合素对此条通路的调控作用。

总体来讲，目前研究整合素通路本身或软骨中整合素通路的文献较为纷繁，而以KOA疾病为核心来讨论整合素调控的篇目相对来说较少，因此整合素与KOA发病机制间相关性的研究结论实际需要结合KOA病理基础与整合素实验的结果进行合理的逻辑推论。希望日后有以直接探索KOA发病机制与整合素间作用为目的的研究出现，或者有更多以KOA患者关节软骨为研究对象的实验诞生，相信对于整合素参与KOA发病机制的探索将更为深入与明确。