CircRNAs在缺血缺氧微环境中的作用

安兰花 张金生

缺血性心脑血管疾病是具有相同病理基础不同临床表现的一组疾病，指血管狭窄、粥样硬化或梗死造成局部供血的减少，进而导致心脑缺血，是我国人群致残、致死的重要原因。其病理基础是局部心脑组织的急性缺血形成缺血缺氧微环境，严重影响细胞的迁移、增殖、凋亡、衰老等。环状RNAs(CircRNAs)是一种内源性非编码RNAs，具有微调基因组与各种微环境相互作用的能力。研究表明，CircRNAs与缺血性心脑血管疾病关系密切[1-5]，主要涉及能量代谢、血管生成、细胞凋亡、炎症等，有望成为心脑血管病临床诊断和治疗的候选者。本研究就CircRNAs与缺血缺氧微环境关系的研究进展进行综述，以期揭示缺血性心脑血管疾病发病机制的共性以及潜在的治疗靶点。

1 CircRNAs与缺血缺氧微环境的关系

微环境是细胞赖以生存的“土壤”，可全方位调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等。当缺血性心脑血管疾病发生时，局部组织缺血缺氧可诱导发生复杂的生化级联改变，导致代谢异常、炎症募集、自由基过度产生，激活多种信号通路释放多种细胞因子导致组织损伤与修复失衡。CircRNAs与缺血缺氧微环境关系密切。研究显示，在小鼠短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)后7 d采用circHIPK2 siRNA转导神经干细胞(circHIPK2 siRNA neural stem cell，si-circHIPK2-NSCs)并将其注射到侧脑室，发现si-circHIPK2-NSCs可迁移至缺血半暗带区，增加缺血区神经元可塑性，产生持久的神经保护作用，而沉默circHIPK2可促进神经干细胞(NSCs)定向分化为神经元[6]。不同的circRNAs具有不同的作用。Wu等[7]研究结果显示，tMCAO模型小鼠脑组织CircTLK1水平明显升高，敲除CircTLK1可缩小脑梗死体积，减轻神经元损伤，改善神经功能缺损。而Bai等[5]研究却表明，tMCAO模型小鼠过表达circDLGAP4可明显减轻神经功能缺损和血脑屏障损害，缩小脑梗死。现从以下几个方面阐述CircRNAs与缺血缺氧微环境的关系。

1.1 CircRNAs参与代谢调节CircRNAs参与调节与缺血缺氧微环境有关代谢的多个环节。首先，CircRNAs可参与调控缺血缺氧微环境中不同代谢途径进而参与能量代谢的调节。Lin等[8]研究脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤模型发现，mmu-circRNA-015947可能通过代谢和免疫相关途径参与细胞凋亡。Ostolaza等[9]研究发现，针对缺血性卒中患者，CircRNA 可能通过与脂肪酸生物合成或赖氨酸降解有关的miRNA相互作用发挥功能调节，但具体机制尚待进一步研究。随着缺血时间的延长，缺血区微环境处于高度复杂的动态时空演变，CircRNAs也随缺血时间延长参与不同的代谢途径。Lu等[10]研究结果显示，局灶性脑缺血小鼠于卒中后5 min、3 h和24 h CircRNAs分别参与不同的信号途径，其中在MCAO后3 h CircRNAs主要参与细胞色素P450对外源物质的代谢以及乳酸和新内酯系列的糖鞘糖脂的生物合成，而在MCAO后24 h参与脂肪酸代谢。其次，CircRNAs参与调节能量代谢的直接供能物质——ATP。Cai等[11]研究发现，心肌梗死模型大鼠缺血心肌细胞CIRC-Ttc3的过表达可逆转miR-15b诱导的Arl2表达抑制，相反，敲除Arl2则部分消除了CIRC-Ttc3过表达对心肌细胞ATP产生和凋亡的有益作用。circRNA4087也参与缺血缺氧微环境中心肌细胞中ATP的产生。闵捷[12]研究发现，心肌I/R模型大鼠circRNA4087显著上调，随后的体外细胞实验表明，过表达circRNA4087可抑制心肌细胞活力，降低心肌细胞内ATP含量，促进心肌细胞凋亡，而下调circRNA4087可保护心肌细胞内ATP含量，降低线粒体活性氧的生成，抑制心肌细胞的凋亡。上述多个研究结果表明，CircRNAs可通过调节代谢通路以及ATP在缺血缺氧微环境中后发挥作用。

1.2 CircRNAs调节血管生成CircRNAs可参与血管生成。其中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)参与促进血管生成的早期事件。在缺血缺氧后24 h内，大量的VEGF和其他可溶性细胞因子应激性增加，进而促进内皮细胞产生和血管再生。因此，VEGF和血管内皮细胞与血管生成关系密切。研究发现在缺血缺氧微环境中CircRNAs与VEGF信号通路相关[13]。CircFndc3b是心肌内皮细胞表达的一种CircRNA，可通过调节VEGF的表达和信号转导，增强血管生成活性，减少心肌细胞和内皮细胞的凋亡，改善左心室功能[14]。同样，沉默hSA_CIRC_0007623可以上调miR297，下调VEGFa的表达，减少细胞的增殖、迁移和血管生成，从而促进急性心肌缺血后的心脏修复，保护心功能[15]。CircNfix可能通过CircNfix/miR214/GSK3β信号通路调节心肌细胞中VEGF的释放进而参与调控心肌梗死后的血管生成[16]。CircRNAs可受缺血缺氧微环境的影响调节血管内皮细胞促进血管生成。hSA_CIRC_0010729通过miR-186/缺氧诱导因子-1a轴调控内皮细胞的增殖和迁移活性，促进细胞的凋亡，从而在缺氧诱导的内皮细胞功能中起重要作用[17]。CircRNA cZNF292是表达最高的和显著受缺氧调控的CircRNAs之一，研究发现沉默CircRNA cZNF292可抑制cZNF292的表达，减少体外培养内皮细胞的血管形成和球体萌发[18]。CircHipk3通过海绵吸附miR-133a可促进新生血管的增殖[19]。然而，不同的CircRNAs可以通过不同的机制参与内皮细胞的调控。缺氧预处理的心肌细胞释放的外泌体circHIPK3通过miR-29a/胰岛素样生长因子-1途径调节心脏微血管内皮细胞的氧化损伤[20]。Chen等[21]采用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells)建立体外I/R模型发现circDLPAG4/HECTD1通过内质网应激介导内皮细胞的功能障碍。因此，调控CircRNAs促进血管生成或可能成为促进缺血性脑血管疾病损伤区组织再生和修复的重要途径。

1.3 细胞凋亡随着缺血缺氧时间的延长，相应的病理因子和信号通路被激活，导致促凋亡和抗凋亡平衡破坏，致使濒危的细胞最终走向凋亡。而CircRNAs可通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)、Wnt/β-catenin等多种信号通路调控缺血区细胞的凋亡。

1.3.1ERK相关信号通路：Ras/Raf/MEK/ERK信号通路又称ERK信号通路，能将细胞外信号传递入细胞核内，引起细胞内特异蛋白表达谱变化，从而影响细胞的存活。而Wnt信号通路是细胞凋亡的主要信号通路。β-catenin是Wnt/β-catenin信号转导通路的核心分子，经典的Wnt信号通路可通过激活β-catenin向细胞核内传递信号，启动下游的靶基因。CircRNAs可通过这些信号通路参与调控缺血缺氧微环境中细胞的凋亡。Cao等[22]针对缺氧缺糖再灌注诱导的NSC损伤研究发现，沉默cZNF292可促进NSCs生长并抑制NSCs凋亡，其机制与上调miR-22诱导了Wnt/β-catenin和蛋白激酶C/ERK通路的激活有关。Shao等[23]采用体外氧糖剥夺(OGD)处理模拟心肌缺血研究发现，CircDENND2A过表达可通过下调miR-34a表达和β-catenin及Ras/Raf/MEK/ERK途径，增强缺氧细胞的存活和迁移，降低缺氧诱导的细胞凋亡。Jin等[24]采用心肌细胞缺氧缺糖损伤模型研究发现CIRC_0010729通过上调miR-145-5p激活mTOR和MEK/ERK通路，调控心肌细胞凋亡。

1.3.2Akt信号通路：Akt信号通路在缺血时被激活，是细胞存活的重要信号通路。在脑I/R损伤引起的细胞凋亡机制研究中发现，CIRC_008018沉默或miR-99a过表达可部分逆转I/R引起的Akt和GSK3β磷酸化水平的降低，最终影响细胞的凋亡[25]。此外，破裂和完整的质膜通常分别被认为是坏死性和凋亡性细胞死亡的标志。CircRNAs与细胞膜的动态平衡密切相关。ORP5是锚定在内质网-质膜接触点。Shang等[26]研究发现，CIRC_0001449可作为miR-124-3p和miR-32-5p的海绵竞争内源RNA，促进tMCAO模型小鼠Osbpl5翻译进而调节细胞膜的动态平衡，并参与Akt的生存途径。

1.3.3通过miRNA发挥作用：目前研究发现CircRNAs可以与miRNA结合共同调节细胞的增殖、分化、凋亡等过程，然而不同的CircRNAs发挥不同的作用。一方面，CircRNAs可与miRNA促进细胞的凋亡，加重缺血缺氧性损伤。Zhao等[27]研究表明，在缺血性卒中患者血清和MCAO小鼠缺血脑半球中均发现circ-0072309表达与miR-100表达呈负相关，circRNA hSA_CIRC_0072309可作为miR-0072309海绵，下调circRNA hSA_CIRC_0072309，促进缺血缺氧区细胞凋亡，并推测circ_0072309-miR-100-mTOR可能是缺血性卒中潜在作用靶点。Geng等[28]研究发现，CircRNA Cdr1as通过调节miR-7a促进缺氧心肌细胞凋亡，加重心肌梗死。另一方面，CircRNAs通过调控凋亡过程，减轻缺血缺氧性损伤。Cai等[11]研究发现CIRC-Ttc3通过miR-15b-Arl2级联在心肌梗死后缺氧诱导的心肌细胞凋亡、心肌梗死和心功能障碍中发挥保护心脏作用。Zhao等[29]研究结果显示，在心肌梗死患者中CircMACF1过表达可通过调节miR-500b-5p/EMP1轴减少心肌细胞凋亡，增加左心室射血分数和左心室缩短分数，降低左室收缩末期内径和左室舒张末期内径，降低血清肌酸激酶 MB和乳酸脱氢酶水平和心肌梗死范围。Wang等[30]研究表明CircRNA DLGAP4通过靶向miR-143调节BCL2而改善心肌I/R损伤中的心肌细胞凋亡，并推测CircDLGAP4/miR-143/BCL2轴可能是心肌I/R中潜在的心肌细胞凋亡调节轴。Li等[31]研究表明，沉默CircNCX1可降低促凋亡基因细胞死亡诱导蛋白(CDIP1)水平，减轻细胞凋亡和I/R损伤，并揭示缺血性心肌损伤中心肌细胞的凋亡是由CircNCX1/miR-133a-3p/CDIP1通路介导的，而且CircNCX1充当miR-133a-3p的海绵。

1.3.4自噬相关通路：自噬是维持细胞内环境稳定的一个重要机制，与缺氧引起的细胞凋亡密切相关。CircRNAs参与自噬的调节。ACR是一种自噬相关环状RNA，可通过ACR-PINK1-FAM65B轴参与心肌梗死后心肌细胞自噬和凋亡[32]。针对小鼠tMCAO模型的研究结果显示，CircRNA HECTD1可以通过调节自噬方式靶向MIR142-TIPARP通路调节星形胶质细胞的激活，明显减少梗死面积，减轻神经元缺陷[33]。此外，线粒体自噬可介导细胞程序性凋亡和坏死细胞死亡，在维持微环境稳态中发挥重要作用。禹文峰等[34]有关脑I/R损伤机制研究发现，外源性circRNA4736通过竞争结合miR-206，解除miR206对Seipin的3′UTR区的抑制作用，从而重新激活Seipin蛋白生物学功能，进而促进Seipin介导的线粒体自噬，最终抑制神经元的凋亡。

1.3.5其他信号通路：除上述调控细胞凋亡的信号通路外，CircRNAs也可通过TNF信号通路和线粒体分裂和凋亡相关通路参与缺血缺氧微环境中细胞凋亡的发生。Song等[35]研究结果表明，CircTLK1可通过靶向miR-214/RIPK1介导的TNF信号通路加重心肌I/R损伤，促进细胞凋亡。Wang等[36]研究表明MFACR是线粒体分裂和凋亡相关的CircRNAs，通过直接靶向和下调miR-652-3p来调节心脏中的线粒体分裂和凋亡，进而通过抑制MTP18翻译来阻止线粒体分裂和心肌细胞死亡。

1.4 CircRNAs调节炎症反应炎症反应密切参与缺血级联的所有阶段，从血液供应中断引发的早期血管损伤事件到导致缺血后组织修复过程[37]。不同的CircRNAs可发挥不同的作用。据报道CircRNA HECTD1可参与巨噬细胞活化从而参与SiO2诱导的炎症反应[38]。Han等[33]研究小鼠tMCAO模型发现CircRNA HECTD1对急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)发病机制具有调节作用。随后Peng等[39]在CircRNA HECTD1表达与AIS疾病风险的研究中也发现，CircRNA HECTD1表达与患者美国国立卫生研究院卒中量表(NIH stroke scale)评分和炎症因子水平(CRP、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-22)呈正相关，即CircRNA HECTD1上调了促炎细胞因子的水平，刺激了炎症和免疫反应，从而加速了疾病的进展以及AIS的复发。然而Zhu等[40]研究却发现CircRNA DLGAP4在AIS中被下调，并且与患者的严重程度、炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8，IL-17和IL-22)表达和促炎基因miR-143表达呈负相关。虽然炎症反应在缺血性疾病中占重要地位，但目前关于缺血缺氧微环境中circRNAs在炎症方面的机制研究较少，仍待后续研究进一步揭示circRNAs在炎症反应中的调控机制。

2 总结与展望

综上所述，目前尽管针对CircRNAs的研究尚在起步阶段，但现有研究初步发现CircRNAs可通过不同的机制，包括能量代谢、血管生成、炎症反应、细胞凋亡等，影响缺血性疾病的损伤与修复。缺血性心脑血管疾病发病机制处于动态的时空演变中，目前的研究尚缺乏CircRNAs随缺血时间延长的动态追踪研究，而且参与调控疾病及促进修复涉及的多种因子及信号通路之间也很复杂，具体机制仍需进一步研究。以缺血缺氧性微环境为切入点并从转录水平解读缺血性心脑血管疾病发病机制的共性具有重要的科学意义，也为从转录层面治疗疾病提供了基础。但就目前研究水平而言，通过靶向调控CircRNAs实现缺血性心脑血管疾病治疗存在很大困难。通过改良缺血缺氧微环境进而影响CircRNAs表达或可成为缺血缺氧性疾病治疗的潜在途径。因此，深入研究缺血缺氧微环境中 CircRNAs表达谱的变化，对缺血性心脑血管疾病损伤组织再生与修复可能具有重要的潜在价值。