不同发酵方式对发酵马肉肠贮藏期品质劣变及食用安全性的影响

周建中，高 蕾，严宏孟，徐杨林，伊力夏提·艾热提

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

由于现代生活水平的不断提高，人们不再满足于饱腹之欲，而是转变为追求口感愉悦、口味新奇以及促健康的高品质（色泽、风味、营养物质、安全性）食 品[1]。马肉在肉类中极具代表性，含高蛋白质、低脂肪[2]。新疆具有丰富的马匹资源，马肉也是当地人们餐桌上常有的美食，多为熏马肠、熏马肉、新鲜灌肉肠等。因此，马肉新产品开发和精深加工可带来一定的社会效益。

发酵肠类产品是将肉糜或肉块经糖、盐、香辛料混合腌制、灌肠后在自然或人工直投发酵剂条件下，利用微生物发酵，再经恒温干燥成熟制备的具有独特发酵风味、高营养、易消化吸收以及具有良好耐贮藏性的一类发酵肉制品[3]。但自然发酵法难以保证高产量，并且风味难以达到理想要求，不能确保品质及安全性。因此，国内外致力于运用菌种进行直投式发酵，可以起到抑制有害微生物生长、延长货架期、改善色泽及风味等 作用[4-5]。Ben Slima等[6]研究发现，利用嗜酸链球菌和植物乳杆菌混合发酵香肠可提升产品感官和卫生品质。如今，发酵肉制品的安全性引发高度关注，过多生物胺的产生是食品被微生物污染的一个重要指标[7]，产品因受到原料品质、发酵条件及贮藏时间等影响会积累生物胺类有害物质，具体是由于产品在整个生产过程中生成的蛋白酶作用于蛋白质形成氨基酸，而后发生脱羧作用，或者醛和酮氨基化生成具有生物活性的小分子质量含氮有机化合物[8]。摄入少量生物胺有益于机体的一些重要功能，可提高人体免疫力、代谢活性及神经系统活性[9-10]，一旦摄入过量，人体将产生一系列不良反应，生物胺可能会在体内蓄积，从而引发中毒等严重的毒理学反应[11]。 组胺是对人体健康机制最具影响的一类生物胺，可引发头晕、腹泻、呕吐等症状[12]。其次为酪胺，可导致偏头痛，而组胺毒性会因尸胺和腐胺的存在增强，还会产生致癌物质。Van Ba等[13]发现，通过接种肉葡萄球菌和清酒乳杆菌的复合发酵剂可有效降低发酵香肠中酪胺和腐胺的含量，因此，稳定发酵香肠贮藏阶段品质及控制有害生物胺的过度产生十分重要。近年来，有关马肉产品中生物胺含量变化对食用安全性影响的研究较少。

本研究制备以植物乳杆菌E11、汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445复配发酵剂发酵和单一乳酸菌发酵马肉肠，以自然发酵马肉肠为对照，分析不同发酵剂对发酵马肉肠贮藏期间的品质劣变情况及安全性的影响，为发酵肉制品的产业化生产提供更多可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马肉 新疆远航食品有限公司；食用盐、味精、胡椒粉、孜然粉、白砂糖、十三香、味精、姜粉、料酒 市售。

三氯甲烷 东莞市乔科化学有限公司；MRS培养基、麦芽汁培养基、营养肉汤培养基 北京奥博星生物技术有限公司；汉逊德巴利酵母菌1808（Debaryomyces hansenii1808）、木糖葡萄球菌21445（Staphylococcus xylose21445） 中国工业微生物菌种保藏管理中心；植物乳杆菌E11（Lactobacillus plantarumE11）由本实验室筛选获得，现存于新建农业大学食品科学与药学学院。

1.2 仪器与设备

Binder KB系列生化培养箱 济南鑫晟生物技术有限公司；Whatman 1号滤纸 英国肯特郡梅德斯通 公司；AVC-4D1超净工作台 河南兄弟仪器设备有限公司；GF29DA高压灭菌器 北京天赐科仪商贸有限 公司；101-2电热恒温鼓风干燥箱 绍兴市景迈仪器设备有限公司；紫外-可见分光光度计 众邦企业（天津） 国际贸易有限公司；Thermo Scientific KR4i大容量冷冻离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；NR10QC色差仪 深圳三恩驰科技有限公司；LC-2010-HT高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵马肉肠加工工艺

1.3.1.1 工艺流程

马肉预处理→接种与腌制→灌肠→浸洗→静置→ 发酵→烘烤→蒸煮→包装。

1.3.1.2 基本配方

原料肉100.00 g、料酒0.50 g、白糖5.00 g、食盐2.20 g、孜然粉0.23 g、白胡椒粉0.10 g、五香粉0.20 g、十三香0.50 g、味精0.10 g、姜粉0.30 g、白胡椒粉0.10 g、孜然粉0.23 g、100.00 mg/L亚硝酸盐溶液500 mL、大豆分离蛋白2.00 g。

1.3.1.3 操作要点

1）将实验前期经耐盐、耐胃肠液驯化获得的植物乳杆菌E11在MRS液体培养基中扩培2～3 代，于 800 r/min、4 ℃条件下离心，弃去上清，采用无菌生理盐水洗涤3 次后重悬，调整活菌数至108CFU/mL，按上述操作将汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445扩培、调整至相同菌落数后，待用。

2）将原料马肉的瘦肉绞碎，脂肪切成1 cm3大小，质量比2∶8混合、搅碎，加入糖、盐、白胡椒、姜粉等相关辅料搅拌均匀，于4 ℃条件下腌制30 min；在无菌状态下灌肠，肉与肠衣尽量贴紧，并用无菌水擦拭干净肠衣表面油脂和杂质，随后用无菌针扎孔排出多余气体，30 ℃恒温培养箱发酵20 h，制备的香肠在65 ℃烘烤2 h后终止发酵，随后在蒸煮锅中沸水蒸制20 min，待冷却至室温进行真空包装，于20 ℃培养箱贮存，分别在5、15、25、35、45 d取样进行理化指标检测。

3）复配发酵剂组（FP）：在基本配方的基础上，接种体积比2%的汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳杆菌E11（3∶3∶2，V/V）复配发酵，发酵时间25 h、发酵温度28 ℃、发酵相对湿度75%；单一乳酸菌发酵组（DZ）：在基本配方的基础上，接种体积比2%的植物乳杆菌E11发酵剂，发酵条件同上；未接菌的自然发酵组（ZR）：在基本配方的基础上，不接种发酵剂，发酵条件同上。

1.3.2 pH值和水分活度（aw）测定

准确称取5.00 g发酵马肉肠样品，捣碎后用蒸馏水定容至50.00 mL，浸提30 min后，用pH计测定滤液的pH值。称取约3.00 g样品，搅碎后迅速放入水分活度仪内进行检测。

1.3.3 色差测定

将待测样品均匀切成厚度为2 cm的块状，每个处理组各取3 片，每片测3 个位点。

1.3.4 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]的方法进行测定。

1.3.5 总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[15]中第二法进行测定。

1.3.6 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值测定

参考Qi Suijian等[16]的方法进行测定。

1.3.7 生物胺（尸胺、腐胺、酪胺、组胺）含量测定

参照GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》[17]，测定发酵香肠中生物胺含量。

1.4 数据处理

整个实验做3 个重复组进行测定，以3 组样品数据的平均值和标准差表示最终结果。实验数据运用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，当P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同发酵方式对马肉肠pH值和aw的影响

由图1可知，发酵马肉肠贮藏期间pH值均呈现先下降后上升的趋势。首先，在贮藏初期发生这种变化很大程度上源于香肠内人工接种了产酸菌种，可充分利用马肉中的碳水化合物产生有机酸类物质，从而降低pH值。因贮藏温度的原因，发酵剂生长繁殖能力受到抑制，但FP组pH值始终最低，说明添加复配菌种进行发酵可以迅速产酸；后期由于微生物可降解蛋白质，使其分解产生碱性物质[18]，从而导致3 组发酵马肉肠的pH值逐渐呈现上升趋势，ZR组回升幅度较为显著（P＜0.05），而DZ、FP组回升的幅度不显著。说明接种发酵剂可有效保持产品安全酸度（pH 5.3）环境，低pH值能维持产品口感、色泽、蛋白质结合水的能力以及抑制有害菌种的生长。

图1 发酵马肉肠贮藏期间的pH值变化Fig. 1 Changes in pH of fermented horse meat sausage during storage

由图2可知，随着贮藏时间的延长，3 组发酵马肉肠aw不断下降，其中贮藏25 d后接菌发酵的发酵马肉肠aw下降较为显著（P＜0.05），可能因为微生物的生长使得香肠脱水速率加快[19]。同时较低的pH值环境导致蛋白质发生变性，这与蛋白质持水能力的降低有一定的联系，所以DZ组及FP组的aw降低程度较大，贮藏35 d后 分别达到0.89、0.76，当aw＜0.9时就可抑制食品内腐败菌生长。在一定环境中aw的降低不仅影响许多有害微生物的正常生长，而且对许多水必须参与的生化反应产生影响。可见pH值和aw对产品的贮藏及食用安全的重要性，同时也说明了复配发酵剂的发酵更有益于提高这种安全性。

图2 发酵马肉肠贮藏期间的aw变化Fig. 2 Changes in aw of fermented horse meat sausage during storage

2.2 不同发酵方式对马肉肠色差的影响

当消费者在购买香肠时，首先引起关注的产品感官特征就是表面色泽，所以产品色泽的明亮艳丽可以有助于售卖，红度值（a*）作为香肠的主要参考因子，亮度值（L*）和黄度值（b*）会对最终人们的判断结果产生一定影响。马肉肠贮藏期间的颜色主要受到pH值回升、脂肪氧化作用、亚硝酸盐含量及蛋白质降解的 影响[20]。

由图3可知，贮藏时间明显影响了3 组发酵马肉肠的色泽变化。不同发酵方式的3 组马肉肠L*、a*均呈现先上升后下降的趋势，FP组后期的L*降低程度相对ZR组和DZ组更缓和，贮藏5 d之后FP组和DZ组L*和a*始终显著高于ZR组（P＜0.05），主要是由于贮藏初期，微生物的继续发酵导致产品pH值下降，这有利于亚硝酸盐分解为亚硝酸并与肌红蛋白结合形成亚硝基肌红蛋白，使得马肉肠色泽变得红亮；另一方面，对照2.1节pH值变化，FP组在各贮藏时期的pH值始终较其余2 组低，说明产品色泽变化与pH值存在一定联系，产酸能力与色泽红亮程度呈正相关。3 组马肉肠的b*变化不规律，贮藏后期均向黄色偏移，这与马肉肠氧化有关，但ZR组始终具有较高的b*，说明利用复配发酵剂发酵的马肉肠能够有效维持产品色泽的稳定性，延缓氧化程度，以至于不会快速暗淡、变黄，影响产品的感官品质。

图3 发酵马肉肠贮藏期间的色差变化Fig. 3 Change in color difference of fermented horse meat sausage during storage

2.3 不同发酵方式对马肉肠菌落总数的影响

菌落总数一般用来评定肉制品已被微生物侵染的程度，即清洁状态及其食用安全性，是可有效反映食品在生产加工过程中是否符合有关国家食品安全标准的一 个指标。

由图4可知，3 组发酵马肉肠中菌落总数随着贮藏时间的延长呈现不同的变化趋势。ZR组菌落总数呈显著性递增，从2.10（lg（CFU/g））增至7.26（lg（CFU/g）），不断为有害微生物创造生长条件，从而促使菌落总数最高。贮藏初期，DZ、FP组发酵马肉肠中部分碳水化合物还未完全被消耗，接种的微生物作为优势菌种可继续利用，从而数量呈显著增加（P＜0.05）的趋势，在贮藏15 d之内，ZR组菌落总数均显著低于其他2 组 （P＜0.05），主要因其属于未人工添加发酵剂的自然发酵组，而DZ组接种乳酸菌，FP组接种乳酸菌、酵母菌及葡萄球菌复配发酵剂且均提前进行耐盐性驯化。贮藏时间超过15 d后，FP组含量也较为显著低于ZR组。贮藏25 d后，肉制品中碳水化合物已被消耗殆尽，肠体内水分散失，有益、有害微生物不断相互竞争，最终导致DZ、FP组中菌落总数减少，但2 组发酵肠因水分含量更低、酸度及盐含量更高可有效抑制致病菌和腐败菌的生长繁殖，其中FP组作用更显著（P＜0.05）。

图4 发酵马肉肠贮藏期间的菌落总数变化Fig. 4 Changes in total bacterial count of fermented horse meat sausage during storage

2.4 不同发酵方式对马肉肠TVB-N含量的影响

TVB-N含量是描述肉类食品新鲜程度的一个重要指标。动物性食品在酶和细菌的作用下，使得蛋白质发生分解作用，从而产生氨及胺类等碱性物质，与有机酸类物质结合产生盐基态氮，促使肉类发生腐败，此类物质含量越多，说明肉制品中氨基酸被破坏的越多。由图5可知，3 组发酵马肉肠的TVB-N含量均呈现不同程度的上升趋势，其中ZR组随贮藏时间的延长变化较为明显。自贮藏15 d开始，各贮藏阶段3 组间TVB-N含量具有显著差异（P＜0.05）。GB/T 12516—1990《肉新鲜度测定》规定的肉类新鲜度对应的TVB-N含量为：一级鲜度鲜肉≤15 mg/100 g，次鲜肉15～20 mg/100 g，变质肉＞20 mg/100 g。在贮藏45 d内，ZR组TVB-N含量从6.06 mg/100 g升至16.68 mg/100 g，马肉肠已从一级鲜度肉变为次鲜肉，DZ组和FP组分别从5.72 mg/100 g升至12.6 mg/100 g、5.7 mg/100 g升至10.73 mg/100 g，接菌肠TVB-N含量增长缓慢，符合低于15 mg/100 g的一级标准。此外，产品低pH值环境抑制杂菌生长，降低了含氮化合物因杂菌的利用而产生挥发性含氮物质的含量[21]，与测得的复配发酵马肉肠pH值较低也存在关系。说明菌种发酵可较为显著抑制TVB-N的生成，提升食品品质安全性，特别是使用复配发酵剂进行发酵，这与Yang等[22]的研究结果大体一致。

图5 发酵马肉肠贮藏期间的TVB-N含量变化Fig. 5 Changes in TVB-N content of fermented horse meat sausage during storage

2.5 不同发酵方式对马肉肠TBARs值的影响

由图6可知，3 组不同发酵方式马肉肠TBARs值均呈现不断上升趋势，主要是因为脂肪的氧化不断进行，逐渐增多的次级产物促使TBARs不断积累。贮藏5 d时ZR组已显著高于DZ和FP组（P＜0.05），说明采用自然发酵方式得到的马肉肠较容易氧化变质。相对来说，FP组增长幅度较小，并且显著低于ZR组和DZ组（P＜0.05）。贮藏45 d时，ZR组、DZ组和FP组马肉肠TBARs值分别达到0.55、0.45、0.33 mg/100 g，有关研究[23]发现，汉逊德巴利酵母菌通过促进脂肪分解、抑制脂肪氧化、延缓酸败和产生醇类、酮类、酯类等风味物质赋予香肠良好风味。Perea-Sanz等[24]也发现，汉逊德巴利酵母菌可促进发酵肉制品中脂肪的分解，抑制脂肪氧化。结合图3，产品氧化程度越低，产品颜色越稳定。张大磊等[25]发现，传统腊肠中具有抗氧化能力的低分子质量肽含量可因葡萄球菌而提高，从而起到延缓腊肠氧化的效果。这说明复配发酵剂发酵更具有抑制马肉肠中脂肪氧化的能力，有利于延长产品贮藏期。

图6 发酵马肉肠贮藏期间的TBARs值变化Fig. 6 Changes in TBARs value of fermented horse meat sausage during storage

2.6 不同发酵方式对马肉肠生物胺含量的影响

由表1可知，随贮藏期的延长，ZR组马肉肠4 种生物胺的含量不断积累，且贮藏55 d时尸胺的含量已经达到120.22 mg/kg，超过美国食品药品监督管理 局≤100 mg/kg的要求[26]。而随着贮藏时间的延长，除酪胺外，DZ、FP组的尸胺、腐胺、组胺含量变化均呈现先上升再下降趋势，且贮藏35 d后均已开始低于ZR组。在贮藏前期，ZR组的部分生物胺含量显著低于其他2 组，主要是因为发酵肠中接种的发酵剂在这期间产生蛋白酶作用于蛋白质，使之分解变为氨基酸，氨基酸再经微生物分泌的氨基酸脱羧酶脱羧形成生物胺[27]，使得DZ、FP组生物胺含量激增，而这些微生物主要为肠体内的乳酸菌、微球菌和酵母菌[28]。贮藏后期，ZR组腐胺含量始终偏高，因为未添加发酵剂的香肠中蛋白质快速分解产生鸟氨酸和精氨酸，大量杂菌生长造成腐胺 增多[29]。添加复配发酵剂可有效抑制组胺的生成，贮藏55 d时，FP组（0.25 mg/kg）＜DZ组（0.47 mg/kg）＜ZR组 （1.60 mg/kg），主要因为低pH值环境影响形成组胺前体物质（组氨酸）、微生物产的氨基酸脱羧酶活性[30]，其中木糖葡萄球菌抑制组胺积累。虽然FP、DZ组发酵香肠的酪胺含量变化较没有规律性，但贮藏25 d后ZR组显著高于其他2 组（P＜0.05），也是由于蛋白质加快分解产生酪氨酸造成的。在贮藏后期，接菌发酵的2 组马肉肠中4 种生物胺含量均降低的主要原因与后期菌落总数减少有关。综上所述，接菌发酵的马肉肠可有效抑制尸胺、腐胺、酪胺及组胺的过多积累，特别是使用复配发酵剂能有效提高产品在贮藏期的食用安全性，此结果与 Tsai等[31]的最终结论一致。

表1 发酵马肉肠贮藏期间的生物胺含量变化Table 1 Changes in biogenic amines contents of fermented horse meat sausage during storage mg/kg

3 结论

对3组不同发酵方式加工处理的发酵马肉肠贮藏期间的理化指标、微生物及脂肪氧化等指标进行测定，结果表明：相比未接菌发酵方式，接菌发酵马肉肠具有稳定、品质好的优势，其中使用汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳杆菌E11复配发酵可维持产品外观色泽的明艳、红润，防止变黄变暗，在较长贮藏时间内，长时间维持较低的pH值环境，有效降低aw，保证发酵马肉肠产品不被杂菌污染，从而保持发酵马肉肠拥有良好的产品品质；同时，复配发酵剂发酵还可以抑制TBARs值、TVB-N含量及菌落总数的增幅，有效防止产品因脂肪氧化、蛋白质分解及有害微生物污染造成的腐败变质，对具有毒害作用的尸胺、腐胺、酪胺及组胺释放有抑制作用，这一结果与孙学颖等[32]结论一致，即复合发酵剂发酵肉制品有效抑制发酵香肠加工过程中4 种N-亚硝胺（N-亚硝基二甲胺、亚硝基二乙胺、亚硝胺和N-亚硝基哌啶）及6 种生物胺（酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺和色胺）的积累。发酵剂和香辛料共同作用还可促进发酵香肠pH值和aw的降低，可在减缓甚至改善产品品质劣变、加强其食用安全性、为今后人工添加复合发酵剂应用于肉制品工业生产提供一定的理论依据。