泛素化机制在蜱类免疫反应信号通路中的作用*

施明杰 刘智通 孙 毅

(军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重点实验室，北京 100071)

蜱，隶属于无脊椎动物门蛛形纲蜱目，是一类专职吸血的非永久性体外寄生节肢动物，下分软蜱科(Argasidae)、硬蜱科(Ixodidae)、纳蜱科(Nuttalliellidae)以及新提出成立的恐蜱科(Deomocrotonidae) (Anderson, 2002, 2008; 周锦萍etal., 2011)。蜱是人和动物多种疾病的传播媒介，包括各种细菌、病毒、立克次体、螺旋体等病原微生物。近年来蜱媒疾病的不断发生引起了广泛的关注，许多经典蜱媒疾病，如森林脑炎、出血热、Q热等，以及各种新发蜱媒传染病，如莱姆病、无形体病和2010年发现的发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome disease, SFTS)也在不断威胁着公共卫生安全和人类的健康(Yuetal., 2011)。蜱在叮咬吸血的过程中，病原体随着血餐进入到蜱类中肠，之后通过中肠围食膜屏障进入血淋巴，再由血淋巴输送至唾液腺，利用胞吞作用突破屏障进入蜱类唾液腺，在唾液腺中经过增殖和/或发育后再胞吐随着唾液进入宿主动物(人)体内完成病原体传播循环(Reuben Kaufman, 2010)。不同的蜱媒病原体具有不同的表征，如肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等，可以被媒介蜱种唾液腺细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)特异性的识别，通过形成特定的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)而与唾液腺细胞相互作用(Schwan, 1996; Bugryshevaetal., 2001; Lemaitreetal., 2007; Lindsayetal., 2014)。蜱内唾液腺细胞接收到模式识别受体PRR传递的病原入侵信号后对信号进行进一步的加工整合，以非线性级联反应的方式激活细胞内各种调控通路，如Janus激酶信号转导和转录激活因子通路(janus kinase-signal transducer and activator of transcription pathways, JAK-STAT)、免疫缺陷途径通路(immune deficiency pathway, IMD)和核因子-κB信号通路(nuclear factor-kappa B signaling pathways, NF-κB)等调控通路，产生免疫应答反应(Costaetal., 2009; Robertsonetal., 2009)。与此同时，病原体能够利用各种信号调控通路去调节唾液腺细胞分泌的多种效应分子，如C3、C5补体抑制剂系列和宿主免疫调节因子 Salp系列等，通过分子互作进一步诱导病原体表型或效应分子的改变，从而发挥补体抑制、免疫调节和免疫逃逸等作用，造成病原体在媒介蜱种中的持续性感染，影响着蜱媒病原的传播效能(Bowmanetal., 1997; Valenzuelaetal., 2000; Dasetal., 2001; Gillespieetal., 2001; Couvreuretal., 2008; Shoemakeretal., 2008)。因此，明确蜱媒病原体与唾液腺细胞相互作用的信号调控元件及通路、揭示蜱媒病原传播的分子基础，有助于制定和优化蜱媒疾病的防控策略，从而阻断蜱媒疾病的传播。

蜱类免疫系统与其他无脊椎动物的免疫系统类似，而相比于脊椎动物来说则更加原始和简单，只呈现先天免疫反应(Fogacaetal., 2021)。蜱类的先天免疫主要包括两个方面, 一是体液免疫，其中包括抗菌肽、防御素等；二是细胞防御，即细胞吞噬(phagocytosis)和包囊(encapsulation)作用。在细胞防御中，一些多样化的免疫信号通路(Toll、IMD、JAK/STAT通路)、小RNA干涉通路(RNA inference pathway)和相关重要免疫因子已经被证实参与蜱媒病原的感染和传播过程(Kazimirovaetal., 2013; Kotaletal., 2015; Simoetal., 2017；Aguilar-Díazetal., 2021)。本文就蜱类主要免疫系统信号通路及泛素化在蜱类调控信号通路和免疫逃逸方面的作用进行综述，以期能够为制定蜱媒疾病防控策略提供技术支持。

1 蜱类细胞免疫信号通路

1.1 Toll信号通路

节肢动物有一系列用于预防和控制感染的抗病毒机制，包括RNA干扰(RNA interference)、抗病毒肽如防御素(defensins)和利用Toll受体的检测机制等(Kopaceketal., 2010; Ruckertetal., 2014; Schnettleretal., 2014; Talactacetal., 2017)。Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)是公认的模式识别受体，它们对包括病毒在内的微生物感染起着关键性的作用(Akiraetal., 2004)。通过与不同的病原体基序的特异性结合，TLRs可以激活机体对病原感染的免疫反应。TLRs保守结构是由一个氨基末端富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRRs)的胞外结构域、一个跨膜区和Toll-白介素受体(toll-interleukin receptor, TIR)信号结构域组成(Belletal., 2003)。TLRs在无脊椎动物和脊椎动物中的广泛存在，说明了TLRs对控制感染的重要性(Buchmann, 2014)。在果蝇中，TLRs通过识别细菌细胞壁表面的肽聚糖(peptidoglycan, PGN)和真菌细胞壁中的葡聚糖，形成相应的病原相关分子模式(PAMPs)，从而优先激活Toll信号通路(Lemaitreetal., 2007; Lindsayetal., 2014)。Toll途径中的大部分元件(Smithetal., 2014; Gulia-Nussetal., 2016; Rosaetal., 2016; Oliva Chavezetal., 2017)已经通过生物信息学和基因组学手段在蜱类中发现，但至今尚未有明确的结论。Rosa等(2016)人发现边缘无形体Anaplasmamarginale感染微小扇头蜱RhipicephalusmicroplusBME26细胞系后，Toll信号通路途径成分中大部分元件基因表达下调，并推测这可能与其在微小扇头蜱中感染繁殖和共进化适应有关。相反，肩突硬蜱Ixodesscapularis若蜱Toll基因(ISCW018193)的沉默对吞噬细胞无形体A.phagocytophilum在唾液腺中的定植没有任何影响，但不能排除Toll途径参与吞噬细胞无形体A.phagocytophilum的感染调控(Liuetal., 2012)。因而，在基因层面上，病原微生物感染可能会抑制Toll信号通路的相关元件而促进感染，但尚需进一步验证。未来，依赖已经获得的生物信息学和基因组学数据，对蜱类Toll信号通路关键性元件及其相互作用的深入认知，将有助于发现阻断蜱媒病原传播的关键靶点。

1.2 JAK/STAT信号通路

JAK/STAT信号通路往往被看做是Toll和IMD途径的旁支通路，在调控细菌和真菌感染方面发挥作用。蜱类中的JAK/STAT信号通路的生物学功能也逐渐被认知。在肩突硬蜱中，JAK/STAT调控着吞噬细胞无形体A.phagocytophilum在唾液腺和血淋巴中的增殖和感染，5.3 kDa的AMP是其发挥调控作用的效应器(Liuetal., 2012)。同样，微小扇头蜱中JAK/STAT信号通路与AMPs的调节有关，STAT缺陷导致蜱虫唾液腺中AMPs ixodidin和溶菌酶以及肠道和唾液腺中的防御素下降(Capelli-Peixotoetal., 2017)。此外，围食膜因子-1(peritrophin-1)也是蜱类JAK/STAT信号通路的另一效应物。围食膜因子-1的双向调节作用，既能增加伯氏疏螺旋体Borreliaburgdorferi在肩突硬蜱若蜱肠道中的存活率，从而有利于伯氏疏螺旋体B.burgdorferi的定植；也能通过肠道上皮的修复和更新，扰乱肠道微生物群而调节吞噬细胞无形体A.phagocytophilum含量(Narasimhanetal., 2014; Abrahametal., 2017)。但由于JAK/STAT信号通路中细胞信号跨膜受体Domeless的缺失，蜱类激活JAK/STAT信号通路的方式、其信号接收和传导过程是否有新的跨膜蛋白参与或与别的通路产生交互，还有待进一步明确。

1.3 IMD信号通路

免疫缺陷途径是调控大多数抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)基因表达的最重要的途径(Ferrandonetal., 2007)。存在于蜱的血淋巴、脂肪体、肠道、卵巢和唾液腺等组织或器官中的抗菌肽是经诱导产生的一类具有广泛抗菌活性的碱性多肽物质(Buletetal., 2004; Sonenshineetal., 2008)。这些抗菌肽按来源可分为3类，(1)外源性AMPs，如蜱虫利用宿主血红蛋白衍生的杀血菌素(hemocidins)(Cruzetal., 2010; Dubinetal., 2005)；(2)内源性AMPs(核糖体合成的AMPs)，如microplusins(又称为hebraeins)、防御素(Pelcetal., 2014; Martinsetal., 2019)；(3)通过基因转移而获得的AMPs，如Dae2(Chouetal., 2015)；在不同蜱种中广泛存在，并抵御多种病原微生物产生危害。

研究发现，埃及伊蚊Aedesaegypti体内IMD信号通路激活后能够控制其中肠微生物群的水平，并且也能够允许蚊媒病毒在体内进行复制(Kleinoetal., 2014)。同样的，节肢动物能够利用围食膜和IMD信号通路去对抗肠道中的革兰氏阳性细菌的感染，并且依赖于IMD信号通路途径来控制入侵细菌的排出(Barlettaetal., 2017; Horietal., 2018)。可见，节肢动物中IMD信号通路途径对于控制革兰氏阳性菌的感染传播存在着重要的作用。故而，有理由推测蜱类IMD信号通路途径也应当存在类似功能。

研究证实，果蝇中经典的IMD途径是通过唾液腺细胞表面的肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)来识别细菌细胞壁中存在的二氨基戊二酸型肽聚糖(diaminopimelic acid-type PGN, PG) 来控制的，又称为DAP型肽聚糖 (Lemaitreetal., 2007；Kleinoetal., 2014)。在识别成功后，受到PG的刺激，胞内会形成一类由IMD蛋白、dFADD蛋白以及DREDD蛋白三者组成的三聚体蛋白复合物。该复合物中DREDD蛋白能够被E3泛素连接酶凋亡抑制剂(DIAP-2)通过泛素化的方式激活(Meinanderetal., 2012)。激活后的DREDD裂解IMD并通过依赖K63途径泛素化IMD蛋白，随后依赖于K63多聚泛素化链招募并激活转化生长因子-β激活激酶1(transforming growth factor-beta activated kinase 1, TAK1)，进而依靠泛素结合基序激活TAK1/TAB2(TAK1-binding protein 2, TAK1连接蛋白)复合物，最终通过TAK1/TAB2复合物激活IMD信号通路NF-kB激酶抑制因子(IKK)/Relish分支和JNK通路，Relish通过IKK复合物介导的磷酸化和DREDD的裂解双重控制激活后被切割为两部分，其中羧基端部分留在细胞质中，而活性氨基端部分转移到细胞核启动靶基因的转录(Stovenetal., 2003; Kimetal., 2005; Paquetteetal., 2010)。

然而，通过对蜱类生物信息学数据的分析却发现其IMD信号通路途径缺乏包括跨膜蛋白PGRPs、具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD)、受体蛋白IMD和死亡相关的ced-3/Nedd2样蛋白(DREDD)等许多重要通路元件的同源基因(Smithetal., 2014; Gulia-Nussetal., 2016; Rosaetal., 2016; Shawetal., 2017)。这种IMD途径成分丢失的情况在其他蛛形纲和半翅目昆虫中也同样发生(Palmeretal., 2015; Nishideetal., 2019)，除了基于标准基因结构的错误注释这一可能的原因外(Salcedo-Porrasetal., 2019)，IMD通路元件的同源基因的系统发育和进化也是需要明确的科学问题。

有趣的是，尽管缺少几个元件，蜱中IMD途径仍然具有重要的抗菌功能，并能对不同类的病原体产生响应，并因此被称为“非常规免疫缺陷途径”(Capelli-Peixotoetal., 2017; Shawetal., 2017; McClure Carrolletal., 2019)。蜱类通过识别革兰氏阴性菌细胞膜上的甘油磷脂来激活非常规IMD途径，包括1-棕榈酰基-2-油酰基-锡-甘油-3-磷甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-3-phosphoglycerol, POPG)和1-棕榈酰基-2-油酰基-二酰甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl diacylglycerol, PODAG)，但具体的识别机制仍不清楚，需得到进一步验证，但不可否认的是该通路因此被激活(Shawetal., 2017)。

此外，研究进一步发现蜱类非常规IMD途径上游成分——X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)在信号传导过程中发挥着重要功能。XIAP是一类具有细胞凋亡作用的蛋白，其分子结构中含有两个特征性的结构域：一个是杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(baculoviral IAP repeat, BIR)结构域，另一个是“真正有趣新基因”(really interesting new gene, RING)结构域(Beugetal., 2012; Severoetal., 2013)。其BIR结构域能够与锌原子相结合，而RING结构域则具有E3泛素连接酶活性，可以促进XIAP自身或与其相互作用的蛋白分子泛素化而降解。研究发现，在肩突硬蜱I.scapularis中E3泛素连接酶XIAP能够抑制吞噬细胞无形体A.phagocytophilum在蜱内的定植，通过沉默XIAP，吞噬细胞无形体A.phagocytophilum的定植显著增加，同时还发现XIAP多聚泛素化依赖于其RING结构域催化且通过赖氨酸(K)-63途径，而非K48途径，同时在K63泛素化途径中需要锌来催化，BIR结构域对锌的捕获促进了泛素化过程的实现(Severoetal., 2013)。非常规IMD途径中，XIAP在被POPG和PODAG激活后，能够与异二聚体E2结合酶复合物(the heterodimer E2 conjugating enzyme complex) Bendless:UEV1a特异性地结合，以K63依赖方式结合并泛素化p47底物(Shawetal., 2017)。而泛素化的p47能够与Kenny(又名NEMO)连接，并诱导NF-kB激酶抑制因子β(IKKβ)(又名IRD5)的磷酸化，进而诱导IMD途径转录因子Relish被切割，随后Relish活性N端部分转移到细胞核启动靶基因的转录(McClure Carrolletal., 2019)。进一步的研究也证实了这一级联反应中各种组分确实参与了肩突硬蜱若蜱中吞噬细胞无形体A.phagocytophilum和伯氏疏螺旋体B.burgdorferi定植数量的控制(Shawetal., 2017)。而果蝇经典IMD途径中TAK1和TAB1蛋白基因敲除后对吞噬细胞无形体A.phagocytophilum定植没有影响，从侧面也佐证了蜱中IMD途径的激活和传导与果蝇等其他模式生物中IMD途径具有特殊性(Liuetal., 2012)。借助这一点，针对该非常规IMD途径的继续深入探索，明晰其信号传导反应途经和关键元件如E3泛素连接酶XIAP的系统进化关系对于控制蜱及蜱媒病原的传播具有重要意义。

2 泛素及泛素化在蜱类免疫反应中的作用

2.1 泛素和泛素化

泛素(Ubiquitin, Ub)是真核生物一种高度保守的、由76 aa组成的多肽，可通过E1、E2和E3三种酶的级联反应与其他蛋白质进行结合(Pickart, 2001)。泛素的“信号”是由含有一个或多个泛素连接结构域的特定泛素“受体”识别的(Dikicetal., 2009)。有20多种不同类型的泛素连接结构域，这些结构域嵌入到大量的细胞蛋白中。而泛素修饰就是通过泛素和存在于特殊蛋白中的泛素受体之间的低亲和力、非共价的相互作用来识别，表明这种结合具有高度的动态性和特异性调节的性质。因此，泛素结合和去泛素结合以及泛素连接蛋白一起构成了泛素介导的多种细胞过程调控的分子机制，在信号通路的传导过程中发挥重要的调控功能(Cooketal., 1992; Varadanetal., 2004; Jiangetal., 2011)。

另外，对于泛素来说，可以通过自身赖氨酸残基(Lysine, K)以单一泛素(单泛素化)或多聚链状泛素(多泛素化)两种形式连接到靶蛋白上。不同泛素链类型以及靶蛋白的不同，产生的作用也不一样，例如最常见的K48连接的泛素化链采用扭曲拓扑结构，通常以蛋白酶体的降解作为靶标；相反地，K63连接的泛素化链则采用线性“串珠”状结构，通常被用作激活NK-κB信号通路和细胞存活的关键信号传导，如DNA修复和蛋白激酶激活等(Cooketal., 1992; Varadanetal., 2004; Hoelleretal., 2006; Chenetal., 2009)。此外，通过泛素的其他赖氨酸残基位点连接的多聚泛素链在细胞中也被发现但未确定其功能，如K6、K11、K27、K29、K33；许多类泛素蛋白也能够通过修饰其他靶蛋白而发挥功能，包括SUMO(small ubiquitin-related modifier)、NEDD8、ATG12等(Kerscheretal., 2006; Xuetal., 2009)。

而上述多种泛素化类型都离不开其共性反应过程和关键功能酶，泛素化由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶组成的三级酶联反应组成，作为一种通用的翻译后修饰，广泛应用于免疫系统的各个方面，包括先天免疫系统对病原体的识别和清除、抗原提呈和适应性免疫系统的激活等(Jiangetal., 2011)。研究发现，泛素化底物和泛素链类型的选择很大程度上取决于E2泛素结合酶和E3泛素连接酶，而E3泛素连接酶因其又能严格控制泛素化的效率而成为泛素化级联反应的关键成分(Zhengetal., 2017; Cabezas-Cruzetal., 2019)。对于E3泛素连接酶来说，主要依据其功能结构域分为两种，含有一个RING结构域或一个HECT结构域，用来介导E2泛素结合酶的结合以及泛素化过程，如E3泛素连接酶cullin-RING家族(Petroskietal., 2005)。有趣的是，目前已经证实很多病原体进化出许多方法来利用泛素化系统，例如对关键的免疫蛋白进行降解；通过干扰或阻断重要的抗菌途径中的泛素调节机制；甚至通过劫持泛素系统来促进自身的繁殖和致病。因而对蜱媒疾病的阻断和预防也避不开E3泛素连接酶这一关键元件。

2.2 E3泛素连接酶在免疫信号通路中的作用

研究发现，泛素化参与了Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)下游的NK-κB和分裂素激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)级联反应的激活。例如TNF受体相关因子6(TRAF6)是含有RING结构域的E3泛素连接酶之一，通过与UBC13和UEV1A组成的E2泛素复合物结合，催化K63泛素化链的合成，合成的K63泛素化链进一步导致TAK1激活，从而激活MAPK级联反应；同时，K63泛素化链还能促进TAK1对IKKβ的磷酸化导致IKK磷酸化NF-κB抑制剂(IKK phosphorylates NF-κB inhibitor, IκB)蛋白被F-box蛋白βTrCP(SCFβTrCP)识别，而SCFβTrCP也是E3泛素连接酶复合物的一个亚单位，泛素化作用于磷酸化后的IκB蛋白使其被蛋白酶体降解，使得NF-κB进入细胞核、开启靶基因的表达，从而促进T细胞的增殖、存活和细胞因子的产生(Kanayamaetal., 2004; Sunetal., 2004; Liuetal., 2011; Wangetal., 2001)。

此外，另一种E3泛素连接酶TRAF3也能够被招募到TLRs下游级联反应中，通过激活TBK1和IKKε，导致干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)磷酸化和Ⅰ型干扰素(IFN)的产生(Hackeretal., 2006; Oganesyanetal., 2006)。值得一提的是，不同类型的泛素化可以协同作用来确定特定的信号输出，例如在TLRs下游级联反应中，由于不同TLR受体诱导的途径不同，招募的泛素连接酶种类也不同，其中TLR4诱导激活的途径中，几种E3泛素连接酶介导的细胞凋亡抑制蛋白(cIAP)泛素化而促进TRAF3的降解能够激活MAPK级联反应，而TLR介导的NK-κB的激活却不需要TRAF3的降解(Tsengetal., 2010)。

泛素化在抗病毒感染方面作用的研究发现，在人类中，丙型肝炎病毒能够使用病毒蛋白酶NS3-NS4A来切割线粒体膜上的抗病毒信号蛋白(MAVS)，从而帮助病毒逃避宿主免疫反应造成持续性感染。但E3泛素连接酶包括三基序包含蛋白(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)、Riplet(也称为RNF135)都能够通过泛素化激活维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ, RIG-I)途径，从而通过促进MAVS的大量聚集诱导产生Ⅰ型IFNs来抵御病毒感染(Lietal., 2005; Meylanetal., 2005; Gacketal., 2007; Houetal., 2011; Oshiumietal., 2009)。同样，在细胞质中DNA诱导的IFN途径中，E3泛素连接酶TRIM56能够通过刺激K63连接的干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)多泛素化而促进TBK1的募集(Tsuchidaetal., 2010; Barber, 2011)。此外，E3泛素连接酶TRIM5在限制逆转录病毒感染中也起着关键性作用，TRIM5能够通过泛素化病毒衣壳蛋白并针对降解来限制逆转录病毒，同时病毒衣壳蛋白能够强烈刺激TRIM5合成游离的多泛素链，激活TAK1激酶复合体，启动先天免疫反应(Xiaetal., 2009; Perteletal., 2011)。

此外，在哺乳动物中的研究证实E3泛素连接酶介导的泛素化在抗原提呈、获得性免疫中也发挥重要的调节作用。例如在小鼠树突状细胞(DCs)中，抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APCs)表面MHC-Ⅱ类分子随着DCs细胞逐渐成熟而不再泛素化，这加强了MHC Ⅱ的表达和聚集，增强了抗原提呈能力(Shinetal., 2006; van Nieletal., 2006)；两种E2酶，UBC5和UBC13能够与肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)E3泛素连接酶一起作用诱导表面MHC-Ⅰ类分子的内吞，从而帮助病毒逃避细胞毒性T细胞的杀伤(Duncanetal., 2006)；在T细胞下游信号成分中E3泛素连接酶PELI1的缺失能够导致T细胞的过度激活(Changetal., 2011)；类似的，在B细胞中已经提出了泛素化介导的MAPK和非典型性NF-κB信号通路的激活机制，通过招募E3泛素连接酶TRAF2和cIAP，TRAF2通过K63泛素化链激活cIAPs，cIAP进一步诱导K48泛素化链合成和TRAF3的降解，向胞浆中释放MAPK激酶的信号复合体，随后激活JNK和MAPK级联反应，而TRAF3的降解能够稳定NF-κB诱导激酶(NIK)并使其磷酸化，NIK磷酸化后激活IKKα进而磷酸化NF-κB前体P100，P100随后被E3泛素连接酶复合物SCFβTrCP多泛素化，并被蛋白酶体加工成成熟的p52亚基。然后，p52与另一个NF-κB亚基REL-B一起发挥作用，启动对B细胞存活、成熟和激活至关重要的基因的表达(Neumannetal., 2007; Matsuzawaetal., 2008; Vallabhapurapuetal., 2008)。

2.3 E3泛素连接酶在病原体免疫逃逸中的作用

尽管许多病原体(如病毒和细菌等)缺乏经典的泛素化系统，但为了自身生存，它们进化中具备了通过基因流动和/或趋同进化而获得泛素化相关成分的能力并利用泛素化调控宿主的免疫反应，破坏宿主免疫系统，这反映出泛素化系统在免疫防御中的重要地位。例如，已经发现许多病毒和细菌的E3泛素连接酶与宿主蛋白的序列相似，表明它们是通过基因转移获得的(Zhuetal., 2008; Quezadaetal., 2009; Jiangetal., 2011)。

一些病原体可以通过降解宿主关键性的E3泛素连接酶或是通过抑制泛素化途径、甚至是利用泛素化系统来降解关键性靶标蛋白等不同的方式，来阻断宿主相关免疫反应通路的激活。例如轮状病毒蛋白NSP1通过诱导SCFβTrCP的降解阻断NF-κB的激活(Graffetal., 2009)；沙门氏菌蛋白SseL具有去泛素化活性而抑制IκBα的泛素化(Le Negrateetal., 2008)；HIV蛋白Vpu则通过SCFβTrCP诱导CD4和骨髓基质抗原2(bone marrow stromal antigen 2, BST2)的降解来控制HIV感染(Andrewetal., 2010)。此外，干扰素的分泌对于宿主的抗病毒反应是十分重要的，副黏病毒V蛋白能够通过组装成为cullin-RING E3泛素连接酶复合体来招募STATs蛋白并对其泛素化，进而诱导其降解、阻断JAK/STAT信号通路实现免疫逃逸(Ramachandranetal., 2009)。

同样，病原体也能够通过去泛素化途径来抑制相关免疫信号通路。例如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus)的L蛋白氨基端具有一个OTU结构域，该结构域已知能够介导去泛素化反应，OUT结构域的表达抑制了TNF诱导的NF-κB通路的激活，并且抵消了体内泛素样蛋白ISG15的抗病毒活性(Frias-Stahelietal., 2007; Skaugetal., 2010)。此外，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)编码的ICP0多功能蛋白具有泛素连接酶的活性，能够招募细胞内去泛素化蛋白酶USP7使得TRAF6和NEMO去泛素化，从而抑制了TLR-NF-κB通路(Daubeufetal., 2009)。

2.4 E3泛素连接酶在释放病毒颗粒中的作用

拉萨病毒(LASV)和莫培亚病毒(MOPV)是关系密切的啮齿类虫媒病毒，E3泛素连接酶ITCH虽不参与虫媒病毒Z蛋白的泛素化，但能够与拉萨病毒和莫培亚病毒Z蛋白的PPxY结构域相互作用，参与病毒的组装和传染性子代病毒的释放(Bailletetal., 2019)。同样，埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)的VP40基质蛋白都能够通过其PPxY-L型结构域与E3泛素连接酶中的WW结构域相互作用，以招募宿主的E3泛素连接酶Nedd4、进而促进病毒的复制和释放(Hanetal., 2016)。

上述泛素化过程和E3泛素连接酶作用无论是纵向思考在宿主还是在病原生物中，或是横向思考在免疫相关信号通路的激活和传导、抗病毒感染、免疫逃逸、病毒颗粒的释放等方面都发挥着极其关键且重要的作用，因此，借助E3泛素连接酶这一突破口，深刻认知泛素化和E3泛素连接酶在蜱、病原及宿主动物三者之间的作用尤为关键，可能为未来的蜱媒疾病的防控提供技术和策略。

2.5 E3泛素连接酶在节肢动物免疫反应中的存在、作用及展望

泛素对蛋白质的调节已经在模式生物中得到广泛证实，并作为一种新的疾病干预疗法在临床上采用。但在媒介节肢动物中，冈比亚按蚊Anophelesgambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦库蚊Culexquinquefasciatus、肩突硬蜱、人虱Pediculushumanus、长红锥蝽Rhodniusprolixus的基因组中泛素化途径元件逐渐被发现，同样是E3泛素连接酶的种类远比E1激活酶和E2结合酶多得多，但具体的泛素过程仍不清楚。与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、小鼠Musmusculus和人相比，这几种媒介生物编码的泛素相关基因比例相对较低，如肩突硬蜱中E1激活酶和HECT型E3泛素连接酶含量较低，这预示着蜱类中E3泛素连接酶以RING型为主，这是否表明蜱类对于泛素化功能的利用具有倾向性和特异性还有待证实(Choyetal., 2013) 。

研究已经证实蜱虫叮咬可通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、己糖激酶1(hexokinase, HK1)和磷酸丙糖异构酶1(triosephosphate isomerase 1, TPI1)的差异性泛素化表现来调节宿主皮肤糖酵解途径；同时，通过丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1, MEK1)、26 S蛋白酶体亚基ATP酶3(26 S proteasome subunit ATPase 3, PSMC3)、蛋白酶体α亚基-6型(proteasome subunit alpha type-6, PSMA6)、MHC-Ⅱ和26 S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1(26 S proteasome non-ATPase regulatory subunit, PSMD1)的差异泛素化来调节泛素-蛋白酶体系统、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ抗原提呈途径以及HIF-1信号通路(Wangetal., 2020)。HEK 293 T细胞急性感染蜱媒兰加特病毒(Langat virus, LGTV)时，ATK1或ATK2表达水平下降的同时，会上调AKT3和具有E3连接酶作用的凋亡抑制蛋白(如X连锁凋亡抑制蛋白, XIAP)，这有助于逃避细胞裂解死亡造成持续感染(Kirschetal., 2020)。而凋亡抑制蛋白XIAP则是NF-κB和MAPK信号通路的重要作用靶点。在肩突硬蜱中，XIAP以p47为泛素化底物、调控着肩突硬蜱的免疫信号级联反应，是肩突硬蜱IMD途径的分子变阻器。p47表达的中断能够增加伯氏疏螺旋体和吞噬细胞无形体的定植(Severoetal., 2013; McClure Carrolletal., 2019)。虽然目前对于蜱类中泛素化及E3泛素连接酶的了解如同冰山一角，但也不难看出其在未来对于蜱媒疾病防控的重要作用。

3 结论

E3泛素连接酶及其控制的泛素化反应，在调控媒介蜱类和宿主免疫反应相关信号通路中起着至关重要的作用。对媒介蜱种的泛素化机制的利用是决定蜱媒病原在蜱内的定植、复制、感染和传播的关键效应元件。通过E3泛素连接酶来进一步了解和洞悉蜱类细胞免疫反应和相应泛素化机制对于进一步控制蜱媒病原的感染和传播具有极为重要的意义。泛素化途径在蜱媒病原感染中识别和调控可望成为阻断蜱媒病原传播、开发蜱媒疾病创新性防控策略的有效途径，值得系统研究和深入探讨。