胰腺炎动物模型及相关信号通路研究进展

冯 健

胰腺炎（pancreatitis）是常见的腹部外科疾病之一，由多种原因引起，包括胆石症、酒精中毒或高脂血症等，在我国最常见的病因为胆石症。胰腺炎可分为急性胰腺炎（acute pancreatitis AP）和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis CP)，AP特征为胰腺的急性炎症反应，严重程度不一，80%属于轻症急性胰腺炎；CP的特征是有显著的基质形成，伴有大量浸润性粒细胞（例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞）、单核细胞、巨噬细胞和胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells, PSCs）。二者并非完全独立疾病、研究发现，20%的AP会表现为胰腺炎内、外分泌功能不全，10%的初次发病AP和20%反复发作AP，最终发展为CP[1]。在胰腺损伤过程中，可激活炎症细胞如巨噬细胞和粒细胞，释放多种炎性因子，白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α等。这些炎性因子进一步激活PSCs发展为CP。胰腺炎发病机制复杂，有多条自分泌和旁分泌信号通路参与，彼此相互作用构成一个错综复杂的网络。为了解胰腺炎的发病机制和病理变化，构建胰腺炎动物模型至关重要，其可模拟人类胰腺炎的病变过程，满足不同的研究需要。现将近年来胰腺炎动物模型及相关信号通路的研究进展作如下综述。

1 胰腺炎模型

胰腺的解剖位置特殊，且在胰腺炎发病的不同阶段获得人体组织非常困难。通过构建胰腺炎动物模型可以模拟胰腺炎的发病过程，研究胰腺炎的发病机制，制定更有效的治疗方法。

1.1 雨蛙肽诱导的胰腺炎模型 雨蛙素由澳洲蛙的皮肤中分离，结构与胆囊收缩素（CCK）相似，具有促进蛋白水解酶分泌的功能，导致胰腺腺泡内酶原过早激活释放，损伤胰腺组织。Lampel等[2]于1997年最先给大鼠持续滴注超大剂量的雨蛙素，在1 h内诱导出急性水肿性胰腺炎，之后胰腺损伤逐渐加重，并于12 h达到高峰。雨蛙素诱导的胰腺炎模型操作简单、稳定性强，是目前应用最广泛的AP模型。

1.2 胆胰管注射模型 Schmidt等[3]于1992年采用逆行胰胆管内注射甘氨脱氧胆酸 (glycodeoxycholic acid，GDOC)的方法，导致大鼠胰腺组织出现急性出血坏死。此方法被大家普遍接受，目前为比较规范的AP造模方法。该模型在病因病机及病理等方面与临床上的急性出血坏死性胰腺炎（AHNP）相似。胆汁反流致胰腺炎是由胆囊结石或胆汁反流阻塞进入胰管，导致胰腺水肿，炎性细胞浸润，淀粉酶产生增加，诱发急性胰腺炎，故可以模仿胆源性胰腺炎，该方法优点是可重复、可对比，模型选择性强，缺点是操作费时，注药速度不易控制，只能借助微量泵才能维持理想的注药速度。

1.3 L-精氨酸诱导的胰腺炎模型 L-精氨酸（L-Arg）诱导的模型可产生腺泡细胞坏死，广泛用于研究急性坏死性胰腺炎的病理生理学改变。最初，Mizunuma等[4]和Tani等[5]证实了在大鼠静脉注射过量的L-精氨酸（500 mg/100 g体重）可诱导胰腺腺泡细胞的损伤。在72 h内观察到约75%的腺泡细胞出现坏死，电镜下可见明显的酶原脱颗粒，内质网扩张。其机制可能是注射过量的L-Arg后，胰腺腺泡细胞的氨基酸代谢失衡，蛋白酶合成减少，通过负反馈调节导致酶原被过度激活。其缺点是模型成活率低，胰腺损伤程度不易控制。尚宏清等[6]采用将大剂量L-Arg分次注射的方法，在一定程度上虽降低了模型动物的死亡率，但仍然无法控制胰腺病理改变，故该方法还有待进一步完善。

1.4 胆盐诱发的胰腺炎模型 第一个实验性胆道急性胰腺炎模型由Bernard[7]于1856年通过将胆汁和橄榄油逆行注射到犬的胰腺中而建立，被广泛使用和最佳表征的化学物质，并且用于诱导AP。此外胆碱缺乏，补充乙硫氨酸饮食模型是另一个研究AP和CP发病机制的模型。

1.5 结扎模型 结扎法是一种制作AP动物模型比较简单常见的方法，可模仿胆源性胰腺炎。Pfeffer等[8]于1957年首先提出十二指肠闭襻结扎法。该模型设计原理是模仿人胆管结石致胆道梗阻时，十二指肠腔内压力升高，使胆汁返流进入胰管，胆汁内的胆汁卵磷脂被胰液内的磷脂酶A2分解成溶血卵磷脂；后者可导致胰内蛋白酶在胰腺内被过早激活，破坏细胞膜和导管，导致胰腺组织自身消化。CP小鼠模型中可观察到胰腺萎缩、腺泡细胞损失和纤维化[9]。结扎法更符合动物伦理，损伤轻微，模型同样稳定，但对实验人员的要求也更高。

1.6 酒精性胰腺炎模型 酒精是引起胰腺炎发病的另一个重要因素，在动物模型中它被用来引发CP[10]。Lieber等[11]通过反复给大鼠和狒狒喂食乙醇作为饮食的一部分来研究乙醇对几个器官的影响，这些动物出现了脂肪性肝病、酒精性肝炎以及后来的肝硬化。令人遗憾的是，尽管实验持续时间较长，但仅摄入酒精并不能诱发CP。然而，酒精与各种药物（如谷胱甘肽或溶血磷脂）的结合会加重胰腺炎并导致纤维化。在大鼠观察中，给予等热量利伯-德卡利液体饲料和酒精长达10周，并给予1或3次重复剂量的脂多糖，致使大鼠胰腺星状细胞活化和纤维化。酒精引起的胰腺损伤被认为是由其代谢产物介导的，这种代谢产物激活活性氧，导致腺泡细胞损伤，激活胰腺星状细胞，导致纤维化[12]。

2 分子信号通路

2.1 核因子(NF)-κB NF-κB是一种广泛存在于人体组织细胞中的核转录因子，具有多向性转录调节作用，可参与调节机体炎症反应、胚胎发育、组织损伤和器官修复等生理反应。在外界刺激因子作用下，NF-κB可被激活，调控炎性因子、生长因子、化学趋化因子、巨噬细胞趋化肽、细胞黏附因子、C反应蛋白(CRP)等相关因子的基因转录[13]。目前学者普遍认为NF-κB的活化参与了AP的发病发展过程，NF-κB活化引起炎症因子的级联瀑布式反应，进而导致局部或全身的炎症反应综合征和多器官功能衰竭，可以说NF-κB的活化是AP重要的起始因素之一。目前认为，NF-κB在许多疾病中过度表达，如溃疡性结肠炎、艾滋病(AIDS)、支气管哮喘、感染性休克等，尤其是在SAP中的作用是研究的热点领域，同时也存在争论。Samuel等[14]通过结扎法建立AP模型，在胰腺组织中可以检测到NF-κB活性显著增高，并引起下游TNF-α的水平相应增加。在胰外器官实验中也发现NF-κB高表达，活化的NF-κB可与炎性因子相关的表达基因位点相结合，调控炎性细胞因子的分泌，加重肝细胞损伤。但也有少数学者表示出不同的观点，Steinle等[15]研究表明，在AP发病过程中，NF-κB的活化早于胰腺损伤，可诱导参与自身防御的相关基因转录，防止胰腺腺泡细胞损伤，应用NF-κB抑制剂后反而会加重胰腺损伤；故认为NF-κB的激活可以防御应激反应，保护细胞免受损害。该实验结果的差异可能与胰腺炎动物模型的炎症程度和取材时间点有关。

2.2 TGF-β/ SMAD TGF-β是一种多能细胞因子，在哺乳动物中以三种同种型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）存在，在调节免疫应答、细胞生长、细胞分化和凋亡中发挥着不可或缺的作用[16]。TGF-β通过与其特异性受体结合而介导其下游信号传导，并触发几种SMAD蛋白的激活，这些SMAD蛋白充当从受体到细胞核的信号的主要转导物。受体调节的SMAD（R-SMADs）、SMAD-2和SMAD-3被TGF-β1受体直接磷酸化，并与易位的常见介体SMAD（即co-SMAD、SMAD-4）形成复合物进入细胞核并激活靶基因的转录[17]。早期研究已证实TGF-β参与了AP、CP和纤维化的发病机制。PSC在诱发胰腺纤维化，通过参与SMAD-2、SMAD-3和ERK途径以自分泌方式调节激活和增殖TGF-β中起着关键作用。通过过度表达TGF-β2型受体(pS2-dnR II)的显性负突变形式，仅在ps2/tff1启动子的控制下，观察了用有缺陷的TGF-β信号转导改善雨蛙肽治疗小鼠胰腺纤维化的效果。随后的研究显示，TGF-β信号传导的抑制可以阻止雨蛙肽诱导的胰腺炎[18]。这些研究表明，神经毒素可能需要一个功能性TGF-β信号通路来诱导这些小鼠的急性胰腺炎。相反，TGF-β信号的失活诱导小鼠自身免疫性胰腺炎，表明TGF-β在维持体内免疫平衡和抑制自身免疫方面的重要作用，可以保持胰腺腺泡细胞的完整性。大量证据表明，TGF-β参与了胰腺纤维化，但也发现TGF-α通过上调MMP-1增加了PSC的增殖和迁移，这可能有助于了解CP的发病机制。最近的一份报告显示，在促进胰腺化生、胰岛发育和纤维化方面，Smad-4与TGF-α的过度表达失去协同作用。此外，在胰腺炎症过程中，较高水平的TGF-β1会引起微RNA-217-SIRT1通路的放松调节，进而促进胰腺的纤维化。而且，TGF-β也激活了包括MAPK通路和磷酸肌醇（PI）3激酶在内的SMAD独立信号通路，但具体的机制还不太清楚。

2.3 MAPK 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）有三种类型，即ERK、JNK和P-38，在包括细胞增殖、细胞存活、凋亡和细胞因子产生在内的多种细胞过程中起着重要作用[20]。在酒精性胰腺损伤中，乙醇及其代谢产物乙醛在PSC中诱导激活蛋白-1（AP-1）和MAPK信号[19]。此外，CX3CL1[20]是一种作为黏附分子和迁移因子的趋化因子，在酒精性CP患者中升高。最近的一项研究表明，乙醇通过ERK激活诱导PSCs中的CX3CL1释放。然而，H2O2在PSC中诱导氧化应激、AP-1、MAP激酶途径和α（I）前胶原的表达。除此之外，PDGF还诱导了Raf-1、ERK 1/2和AP-1蛋白的快速激活，进一步表明ERK活性和PSC激活之间存在相关性。此外，蛋白酶激活受体-2（PAR-2）参与了胰腺炎的发病机制，PAR-2激动剂通过激活PSCs中的JNK和P-38 MAP激酶途径增加了胶原合成，提示PAR-2在诱导胰腺纤维化中的作用。PD98059是一种MAP/ERK激酶-1（MEK-1）途径的抑制剂，能够保护小鼠免受雨蛙肽诱导的急性胰腺炎的影响。除此之外，血管紧张素II治疗的PSCs通过表皮生长因子受体激活ERK激活途径开始增殖并增加DNA合成，这表明血管紧张素II可能在胰腺纤维化的发生中发挥作用。总之，这些研究拓宽了我们的知识，以了解MAPK信号通路在胰腺炎相关纤维化发展中的作用，但仍然存在几种可能相互交叉的分子信号通路在其中起重要作用,对胰腺纤维化的具体机制仍需要进一步探索。

2.4 Rho激酶 在CP中，PSC的激活和诱导的应激纤维形成表明细胞骨架蛋白的重组参与了这种疾病的进程。RHO家族蛋白质RhoA、Rac和Cdc42被认为是通过响应外部信号重塑细胞骨架来诱导应激纤维形成和调节细胞黏附的核心分子。此外，RhoA信号抑制剂通过抑制F-肌动蛋白聚集物降低了重症急性胰腺炎患者肺损伤时内皮细胞的高渗性。cyl Rho激酶抑制剂，如Y-27632和HA-1077（Fasudil），通过降低α-SMA、增殖、趋化性和培养激活的PSC中I型胶原的产生来阻断PSC的活性[21]。在神经毒素诱导的小鼠胰腺炎中，Y-27632在第一次注射雨蛙肽后12～18 h诱导血清淀粉酶水平升高、间质水肿和空泡形成。Y-27632反过来抑制了第一次注射雨蛙肽18 h后Rock-II蛋白表达的恢复。这些结果表明，RhoA和Rock-II在正常CCK刺激的胰腺酶分泌中积累，并预防了雨蛙肽诱导的急性胰腺炎。在急性胰腺炎和随后的CXC趋化因子形成、中性粒细胞浸润和组织损伤过程中，发现Rho激酶信号调节胰蛋白酶原激活及其从胰腺腺泡细胞的释放。

因此，这些结果表明，Rho激酶可能作为今后治疗胰腺炎一个新的分子靶点，但尚需进一步了解Rho激酶信号在胰腺炎中的作用。这一领域为未来的研究开辟了一条新的道路。

2.5 JAK/STAT JAK/STAT信号通路调节多种细胞功能，如细胞增殖、分化和炎症反应。IL-6是一种众所周知的促炎细胞因子，通过JAK/STAT信号通路介导其作用，在胰腺炎的进展中起着关键作用[22]。各种报告表明，与健康人相比，胰腺炎患者的血清IL-6水平更高。此外，体外研究还表明，在多种炎症介质的影响下，如TNF-α、IL-17、IL-1β和FGF-2，诱导人胰腺腺泡周围肌成纤维细胞分泌IL-6；这些数据进一步表明了IL-6在急性胰腺炎发病机制中的关键作用。研究证明，使用抗IL-6抗体阻断IL-6可抑制胰腺腺泡细胞中的STAT-3激活，从而通过诱导胰腺腺泡细胞凋亡，降低急性胰腺炎的严重程度[23]。除此之外，另一项研究表明[24]，PDGF通过激活JAK-2/STAT-3通路诱导PSCs的增殖。JAK-1/STAT-1抑制剂通过抑制NF-κB的激活来减轻胰腺损伤的严重程度，这表明JAK-1/STAT-1的激活参与了胰腺损伤的早期事件。目前仍需更好地了解JAK / STAT信号通路，以了解其在PSCs增殖和CP纤维化进展中的作用。

2.6 PI3K-AKT PI3K-AKT是一个重要的细胞内信号通路，属于脂蛋白激酶家族[24]。当生长因子与膜结合受体酪氨酸激酶结合时，它激活PI3K及其下游调节因子Akt和mTOR，并调节细胞生长、存活、凋亡和炎症等几个方面。PI3K抑制剂可降低腺泡细胞中胰蛋白酶原的胰腺内激活，并降低严重急性胰腺炎大鼠的炎性细胞因子，提示PI3K通路参与了急性胰腺炎的发病机制。PI3Kγ是PI3K的一种亚型，已知在胰腺炎期间调节胰腺腺泡细胞的病理反应。在两种不同的急性胰腺炎模型中研究了PI3Kγ的作用：雨蛙肽和胆碱缺乏/蛋氨酸补充饮食，结果显于缺乏PI3Kγ基因的小鼠受到腺泡细胞损伤/坏死的保护，急性胰腺炎的严重程度降低，表明PI3K抑制剂可能为急性胰腺炎提供一种可能的治疗方法[24]。

本综述介绍了雨蛙肽注射法、L-精氨注射法、胰管结扎法和酒精法制作动物AP模型，各法诱导胰腺炎模型机理不尽相同，大多具有重复性好、模型稳定的优点，但病理改变具有剂量和时间依赖性，研究人员需要根据具体要求选择一种或两种造模方法，更加符合临床胰腺炎的发病过程和病理变化。采用几种损伤因素协同作用制作CP动物模型，接近人类慢性胰腺炎发病过程，但损伤机制与人类慢性胰腺炎并不相关，不能完全反映人类CP的病理特征，导致实验研究有一定局限性，目前多用于实验研究药物的治疗效果。所以，目前的胰腺炎动物模型尚无一种能完全模拟胰腺炎临床实际情况，将来应为胰腺炎的实验研究设计更理想的动物模型。

胰腺炎发病机制复杂，临床上多认为是胰酶异常激活引起胰腺的自身消化，导致大量炎性因子被释放入血，造成胰腺实质损伤；肠道屏障被破坏，菌群异位种植，内毒素及细菌被吸收进入血液系统，触发炎症介质的“瀑布样级联反应”,造成胰腺二次损伤，使得AP从局部病变迅速发展成为SIRS，进而导致MODS。

AP的“白细胞过度激活学说”认为外界各种损伤因素可以激活单核巨噬细胞系统，释放多种炎性因子，进而触发炎症介质被大量释放，导致全身炎症反应和多脏器功能障碍，病情最终发展成为SAP。胰腺炎的发生、发展及演变涉及多条信号通路协同作用，共同调控胰腺炎的病情变化。NF-κB是炎症反应的中心信号通路，JAK/STAT、PI3K-AKT等多条信号通路都可通过其发挥生物效应。检测MAPK可能对胰腺炎的早期诊断提供帮助。PI3K-AKT、MAPK在胰腺炎症级联反应放大中需要通过NF-κB作为下游信号分子介导，调控胰腺炎症反应。实验表明TGF-β、RHO激酶、JAK / STAT参与了胰腺纤维化过程。可见细胞内多条信号通路共同参与介导胰腺炎症反应，目前很多学者都在致力于揭示炎症途径中细胞内信号级联的相互作用，但由于人体内信号通路彼此关联复杂，仍有许多难点亟需攻克，比如信号通路相互作用的关键靶点、具体上下游信号如何相互影响、干扰或阻断相关信号通路磷酸化及调控基因表达，从而抑制炎症反应的关键节点。

3 展望

目前对于胰腺炎相关信号通路的研究取得一定进展，但其内复杂网络系统尚需深入探讨。通过动物模型探讨胰腺炎症反应机制及相关信号通路的调控方法，深入了解胰腺炎的发病机制，为将来临床上精准治疗胰腺炎提供指导。