降钙素基因相关肽对牙正畸移动微环境改建作用的研究进展

纪雅宁，钱素婷，丁玲敏，林 军

Stomatology,2022,42(1):79-83

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是由神经末梢分泌的一种神经多肽，近年来，由于CGRP被发现是神经调控骨改建的关键因子并且与血管及胶原再生有关而备受关注[1]。早在1998年的研究[2]中就已证实，在牙正畸移动(orthodontic tooth movement, OTM)中，CGRP不仅可以传递给牙周膜(periodontal ligament，PDL) 和牙槽骨伤害性刺激，而且在响应OTM发生的神经、血管、胶原及牙槽骨等的改建中也十分重要。生理状态下CGRP阳性纤维约占全部感觉神经的50%，而OTM微环境中CGRP的表达量增加且具有统计学意义[3-4]。正畸治疗过程中，矫治器产生的力通过三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)的瞬时受体电位香草素1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)受体启动CGRP的合成、囊泡运输及分泌过程，CGRP水平上升，对OTM微环境的改建发生作用[5-6]，包括但不限于牙周神经、胶原、血管及牙槽骨的新生。目前，关于CGRP调控OTM微环境改建的机制研究较少，现对其可能机制进行阐述。

1 CGRP及其受体的分子生物学特性

1.1 CGRP的分子生物学特性

降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是降钙素基因相关肽超级家族的成员之一，衍生自CALCA基因RNA转录物的可变剪接，由37个氨基酸组成。人类表达两种形式的CGRP(α-CGRP和β-CGRP)，它们由11号染色体的不同位点转录而来，仅有3个氨基酸的不同，同源性超过90%，发挥着相似的生物学作用[7]。传统上，人们认为α-CGRP是OTM微环境中的主要形式[8]。

CGRP主要位于C和Aδ感觉神经纤维中，由神经节神经元细胞合成，通过轴浆运输到感觉神经末梢，在细胞质内以分泌颗粒的形式储存。在OTM微环境中，CGRP主要由TG合成，随着感觉神经末梢广泛分布于牙槽各处[9-10]，呈血管周围定位性及骨代谢活跃区定位性特征性分布[11]。上述产生及分布特点为CGRP对OTM微环境中骨、血管、神经及胶原的调控提供了先天的优势。

1.2 CGRP受体的分子生物学特性

功能最佳的CGRP受体由两部分结构构成，一部分为G蛋白耦联降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor, CRLR)和受体活性修饰蛋白-1(receptor activity modifying protein-1, RAMP-1)组成的异二聚体，另一部分为受体成分蛋白(receptor component protein, RCP)[12]。

在OTM微环境中，矫治器产生的力刺激三叉神经(trigeminal nerve, TN)神经末梢以旁分泌形式释放CGRP至OTM微环境中，与CGRP受体结合，启动下游信号传导通路，在产生疼痛的同时发挥其生物学调节作用[13]。

2 CGRP对OTM中牙槽骨改建的作用

2.1 CGRP对OTM微环境中干细胞的作用

牙源性干细胞(dental stem cells，DSCs)主要为间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs),来自于胚胎发育过程中的中胚层，具有多向分化潜能，是目前组织工程及再生医学的研究热点[14]。其中与OTM牙槽骨改建相关的且表达CGRP受体的牙源性干细胞主要是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)及牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)[15]。

2.1.1 CGRP促进BMSCs成骨分化及迁移 目前，大家普遍认同BMSCs可以通过Wnt/β-Catenin、BMPs/Smad、TGF-β/STAT信号通路等来调控成骨细胞分化[16]。在对牙槽骨的研究中， Liu等[17]在CGRP缺乏影响牙槽骨内种植体骨结合的研究中发现，下牙槽神经切除术导致的CGRP缺乏会使种植体周围成骨受到抑制，且这一过程由经典的Wnt/β-Catenin通路传递，即CGRP通过PKA信号传导激活糖原合酶激酶-3b(GSK-3b)导致β-Catenin核转运，促进BMSCs的成骨分化及成骨细胞的增殖，进而完成牙槽骨的重塑。王飞及Zhang等[18-19]在体外实验中证明CGRP促进BMSCs成骨分化与Hippo通路有关，CGRP能够上调p-Mst1/2表达,通过效应分子Yap/Taz完成信号的转达。基于目前研究证据可分别证实OTM微环境中CGRP表达上调和高表达的CGRP可通过经典Wnt/β-Catenin通路与Hippo通路等促进BMSCs成骨分化进而加速局部牙槽骨改建，但尚缺乏连续性实验进一步证明CGRP对OTM局部微环境BMSCs的作用。Jia等[20]还发现CGRP给药可以使下颌牵张成骨(mandibular distraction osteogenesis，MDO)大鼠模型中的BMSCs迁移能力增强。实验中，成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和核心结合因子2(runt-related transcription factor2，RUNX2)表达上调， 基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)表达亦上调。而同期针对SDF-1的实验[21]证明，SDF-1既可招募并促进 BMSCs成骨分化又可促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等的表达，可以推测 CGRP通过上调成骨细胞表达 SDF-1 招募并促进 BMSCs 成骨分化加速骨改建，同时与微循环改建相关联，但目前亦没有具体且连续性的实验对此进行证明。

2.1.2 CGRP促进PDLSCs成骨分化 PDLSCs是一类具有自我更新能力、多能性和免疫调节作用的MSCs，不仅可以向同胚层骨样细胞，脂肪样细胞增殖分化，而且可以向外胚层来源的神经元细胞，施万细胞等分化[22]。在OTM中，正畸矫治力可以通过Piezo 1受体及细胞骨架等传递给PDLSCs，也可以通过TG的TRPV1受体启动CGRP的合成和分泌传递[23-25]。王芳等[26]的体外研究证实，CGRP对人PDLSCs成骨分化和成血管能力有正向促进作用，且其与mTOR信号通路有关。除此以外，王林等[24]研究发现OTM中促进PDLSCs成骨分化的激活通路还包括Notch1， OTM微环境中的PDLSCs上调了ALP、Runx2、OCN等成骨相关基因的表达，促进了成骨，但关于CGRP在其中的地位未进行证实。PDLSCs作为组织再生领域的新兴研究热点，针对其的研究相对较少，CGRP促进其成骨的研究亦十分缺乏，具体机制尚需研究者们进一步发掘。

2.2 CGRP对成骨细胞和破骨细胞的作用

成骨细胞胞膜上存在CGRP受体在多年前就已被报道，提示CGRP对成骨细胞有直接作用[27]。

He等[28]从体外实验证实CGRP抑制了OPG/RANKL调控的破骨细胞生成。将成骨细胞与CGRP、CGRP拮抗剂分别孵育，时间到达后检测发现CGRP处理组核因子κB配体受体活化剂(RANKL)的表达呈剂量依赖性下调，通过加入CGRP拮抗剂可以逆转该趋势。同样Yu等[29]的体内实验发现CGRP处理组小鼠在2周时就可检测到 ALP、BSP和RUNX2 等的表达上调。OPG/RANKL比值亦上调，从而较对照组观察到更多的矿化结节。除此之外，Wu等[30]发现了CGRP可诱导成骨细胞中环状RNA(circRNAs)mm9_circ_009056表达的上升以及miR-22-3p的表达减少，进而通过BMPs/Smad 及Wnt/β-Catenin途径提高BMP7、RUNX2的基因和蛋白质水平来加强成骨，抑制破骨，即CGRP表达上调可明显提高成骨细胞的成骨能力。也有研究证实CGRP可通过增强了 BMP2 表达水平促进成骨[31]。

CGRP还可促进成骨细胞自噬[32]，通过细胞内双层囊泡结构的自噬小体吞噬细胞自身蛋白质或细胞器，实现成骨细胞本身的代谢需要和细胞更新，是促进成骨细胞成骨分化的重要调控机制[33]。一方面成骨细胞自噬可促进成骨细胞分化，抑制OPG / RANKL信号通路进而抑制破骨细胞生成。另一方面通过自噬囊泡运输磷灰石晶体促进局部成骨[34]。

CGRP在OTM微环境中可以调节成骨细胞与破骨细胞的动态平衡，促进成骨细胞分化及成骨，抑制破骨细胞形成逐渐成为了研究者们的的共识。

3 CGRP促进OTM微环境中微血管扩张和再生

CGRP受体广泛分布于OTM微血管系统中，始终表达于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)及血管内皮细胞(vascular endothelial cells， VEC), CGRP与微血管中的受体结合，不仅可扩张微血管，也同时促进了微血管再生。

研究显示，CGRP作为血管扩张剂，是前列腺素的10倍以上[35]。CGRP可以通过2种方式介导这种反应：①直接激活其在VSMC的受体并通过Gs-AC-cAMP-PKA通路使K+外流，通过细胞内Ca2+浓度降低来介导舒张;②直接激活其在VEC的受体并通过Gs-AC-cAMP-PKA通路以增强NO的产生，NO可以扩散到血管平滑肌中，通过Gc激活介使K+外流，细胞内Ca2+浓度降低来介导舒张[36-37]。VSMC和VEC具有独立但互补的作用，共同对微循环中血管的扩张起促进作用。

Mi等[38]构建了大鼠牵张成骨模型，在牵张阶段结束时，CGRP组内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的比例和牙槽骨缺损中的毛细血管密度显著上升。进一步研究发现，CGRP通过激活PI3K / AKT信号通路使BMSCs向 EPCs分化。此外，分化的EPCs迅速组装成管状结构并促进BMSC的成骨分化。Guo等[39]用链球菌素构建出了糖尿病大鼠模型并在其头骨植入钛，CGRP组同对照组及假实验组相比VEGF的mRNA表达上升。后续相关实验结果提示CGRP在Y397位点促进了局灶性粘附激酶(focal adhesion kinase, FAK)升高，通过CGRP-FAK-VEGF信号轴导致VEGF的表达变化[40]。 VEGF被认为可以强效地促进VEC的增殖分化以诱导促进新血管的形成。关于OTM张力侧微环境中血管的改建是否符合这一规律尚未有学者进行研究，对此需要进一步验证。

随着新血管生成，OTM微环境中血供增加，骨及神经改建过程中所需的O2及其他营养物质得以满足，过程中产生的CO2及其他代谢产物得以排出，对OTM造成的局部微环境改建产生推进作用。

4 CGRP对OTM微环境神经改建的作用

CGRP是外周神经系统(peripheral nervous system，PNS)再生中不可或缺的组成部分，轴突再生与其密切相关。Wang等[6]构建的大鼠OTM模型中，TG中有1 279个差异表达基因，包括 Atf3、Adcyap1、Bdnf 和 Csf1 的上调以及 Scn10a、Kcna2、Kcnj10 和 P2ry1 的下调，产生类似于神经损伤的转录组变化，不仅在 TRPV1 阳性神经元中，而且在整个 TRPV1 阴性神经元和非神经元细胞中启动正畸力作用后轴突损伤的主动再生程序。

Gomez-Sanchez等[41]提出了髓鞘吞噬(myelin phagocytosis)的概念，OTM微环境中CGRP表达上调可导致转录因子c-Jun上调启动MAPK信号通路，从而诱导有髓鞘的和无髓鞘的施万细胞(Schwann cell,SC)脱分化为有助于髓鞘清除的细胞，便于巨噬细胞(macrophages，ME)侵袭和促进轴突生长。Chung等[13]在上述研究基础上进一步提出，SC也会在Notch和JAK-STAT信号转导下分脱分化，以促进髓鞘碎片形成。从近端开始，SC沿着轨道生长，以轴突生长。SC的髓鞘吞噬会反过来造成CGRP的上调形成神经再生的正反馈。除此以外，这种高度协调的运动是由成纤维细胞通过EphrinB/EphB2信号传导部分控制的，这限制了SC的自我排斥行为，从而允许足够的粘附发生迁移。

5 CGRP对OTM微环境胶原改建的作用

上世纪末，CGRP已被证明可以激活MAPK，MAPK磷酸化后通过PKA依赖性和非依赖性途径促进PDLSCs向成纤维细胞的分化[42]，增殖分化而来的成纤维细胞不断地在OTM微环境中合成胶原纤维。 Feng等[43]构建的大鼠OTM模型中压力侧PDLSCs的I型胶原(type Ⅰ collagen ，Col-Ⅰ)表达受到抑制，压力消除后表达恢复。该过程通过转化生长因子-β(TGF-β)来调节，阻断TGF-β抑制PDLSCs中已恢复的Ⅰ型胶原Col-Ⅰ表达，可以抑制早期复发，即PDLSCs通过TGF-β/ Smad通路调控OTM微环境中的胶原重塑。

6 总结及展望

基于目前研究证据，CGRP对微环境的可能作用机制如下：①招募BMSCs至OTM微环境中并通过Wnt/β-Catenin、Hippo信号通路等促进BMSCs成骨分化，通过PI3K / AKT信号通路促进BMSCs 成血管分化；②通过mTOR及Wnt /β-Catenin、MAPK、Notch1信号通路促进PDLSCs成骨分化，通过MAPK、TGF-β/ Smad信号通路促进PDLSCs成纤维分化，通过mTOR信号通路促进PDLSCs成血管分化；③通过OPG / RANKL， BMPs/Smad 及Wnt/β-Catenin通路抑制破骨分化；④通过成骨细胞自噬促进成骨分化及局部成骨；⑤通过PKA途径扩张微血管，通过CGRP-FAK-VEGF信号轴上调VEGF促进微血管增殖；⑥通过MAPK信号通路促进SC的髓鞘吞噬促进轴突伸长。

目前对于CGRP调控OTM微环境改建具体机制的研究仍然较少，CGRP在OTM中如何控制局部微环境的组织改建以及其中神经、血管、胶原及牙槽骨等组织的改建之间如何建立联系尚待进一步研究。