马的胚胎移植技术研究

2022-11-24李文芳周聪杰陶金良

智慧农业导刊 2022年10期

关键词：肌注前列腺素母马

李文芳，周聪杰，陶金良，张翔

（1.东方马都（天津）有限公司，天津 301700；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

胚胎移植（embryo transfer）是将体内、外生产的哺乳动物早期胚胎移植到同种的生理状态相同的雌性生殖道内，使之继续发育为正常个体的生物技术。运用胚胎移植技术可将供体母马的优良品质较快、较多地遗传给后代。

1 发展简史与实践价值

1.1 发展简史

胚胎移植最早是1890年在兔子上试验成功的，此后山羊、大鼠、绵羊、小鼠、奶牛、猪等胚胎移植后代相继问世。1977年该技术开始应用于生产，至今发达国家已经进入商业化应用阶段。

马属动物首次胚胎移植成功是1972年由Allen&Rowson报道的，他们于1971年在英国剑桥的动物研究所将马、驴、骡的胚胎从供体输卵管中收集并手术移植到19例受体的子宫中，获4例妊娠的结果。同年，日本人Oguri&Tsutsumi报道用非手术法由子宫冲卵收集胚胎并移植而未获成功。1974年他们经过整个子宫冲胚获得90%的胚胎回收率，非手术法移植后获40%的妊娠率（6/15）。1975年Allen等用手术法移植1～6 d龄胚胎获得44%妊娠率（7/16）；非手术移植子宫冲出的胚胎得到71%的妊娠率（5/7）。

马的胚胎移植技术直到20世纪90年代才开始得到商业化的应用。在美国，由于夸特马协会取消了每年每匹母马只允许登记一匹幼驹的规定，因此胚胎移植技术在世界上登记数量最多的马种协会——夸特马协会内就得到了认可。2002年，南美与美国共有超过5 000匹运动母马应用了胚胎移植技术。同年德国尚无1例胚胎移植应用的报道，当年全欧洲也仅有约70匹母马使用了该技术；然而至2004年全德已有309匹运动母马进行了胚胎移植。据国际胚胎移植协会（IETS）资料显示，2003年全球共进行了约20 000例马的胚胎移植处理，应用前景广阔。

1.2 实践价值

马的胚胎移植技术在现代养马业实践中具有广阔的应用价值。

（1）为不能妊娠足月或不能成功分娩的母马孕育后代提供了可能。（2）可以无风险地获得老年母马的后代。（3）为马属动物胚胎的种内或种间移植提供了最佳的妊娠环境。（4）优秀竞赛母马既可参加比赛也可参与配种，不耽误比赛时间。（5）生产冷冻胚胎，为马的遗传多样性保护提供技术支持。（6）为优良马种的引入与扩繁提供技术辅助，简化良种引进方法。（7）提高良种母马的繁殖力，增加每匹母马产驹的个数。（8）促进马的生殖生理理论与胚胎生物技术的发展。

2 操作程序

马的胚胎移植主要包括供、受体母马的选择，供、受体母马的同期发情，供体的配种，胚胎采集，胚胎质量鉴定，胚胎的移植等环节。

2.1 供、受体母马的选择

供体：健康，遗传性能良好，育种价值较高，已证明对超数排卵反应较好。

受体：健康，繁殖性能良好，育种价值不高，体型不小于供体母马。

2.2 供、受体母马的同期发情

在胚胎移植中最耗费时间的步骤是检查供体和受体并对它们进行同期发情处理，供体在发情同期中一旦有优势卵泡出现就要每天检查一次，确定排卵和配种恰当的时间。进行马的同期发情处理时受体母马排卵时间应在供体母马排卵的前1～2 d至后0～3 d之间。对受体母马在发情期9～17 d内进行前列腺素合成抑制剂处理，将受体母马的排卵时间范围扩大为供体母马排卵前4～5 d至后0～3 d之间。据报道最佳排卵时间是受体母马晚于供体母马24 h。

孕激素、前列腺素是诱导母马同期发情的最常用的激素，另外也有用人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促性腺激素释放激素（GnRH）、马垂体提取物等作为诱导母马同期发情的激素。

2.2.1 孕激素

供、受体母马均可用孕激素阴道栓塞法或肌肉注射、口服孕激素法进行同期化处理。连续用孕激素处理15 d，在撤出孕激素后的3～7 d内母马发情现象明显，8～15 d内发生排卵。

此外，也可以连续9～10 d每天注射孕激素或口服合成孕酮，在最后一天注射前列腺素类似物。

2.2.2 前列腺素

用前列腺素处理母马同期发情的效果不够稳定。处理的时间和排卵的时间差异很大，报道的范围在1～10 d之间。放牧的母马由于不易控制发情周期，因此使用2次肌肉注射前列腺素法，间隔时间在14～18 d。用上述方法，60%的母马在第2次肌注后的4 d内开始发情，有92%的母马在第2次肌注后的6 d内表现发情现象。然而，同期化和排卵的时间仍然差异很大，排卵可能发生在第2次肌注后的2～12 d内。

2.2.3 人绒毛膜促性腺激素（HCG）

大部分研究是在第2次肌注前列腺素后的4～6 d内肌注HCG。在第2次肌注前列腺素后的第6天肌注HCG，在此后的72 h内有75.8%的母马排卵。在肌注前列腺素后的第5天肌注HCG获得了相似的排卵成功率。其他一些研究表明使用HCG同期化的效果不明显。还有研究认为分别在第7天（第1次前列腺素使用后的第7天）和第21天（第2次前列腺素使用后的第7天）分别肌注HCG会取得不错的同期化效果。

然而，HCG最大的缺点就是重复使用会产生抗体，但也有人认为这并不够成影响。GnRH及其类似物逐渐取代了HCG的使用。

2.2.4 促性腺激素释放激素（GnRH）

可以通过多次注射（12 h/次）或皮下埋植GnRH的方法完成供、受体母马发情的同期化处理。多项报道显示在用GnRH的商品化药物deslorelin处理后48 h内88%～100%的母马能够排卵。有人认为GnRH与HCG相比，诱导大而厚的卵泡排卵成功率更高，而且GnRH不会产生抗体。

2.3 供体的配种

经过超数排卵的母马发情后应适时配种，应使用活率高、密度大的优秀种公马精液，而且输精次数和每次输精的有效精子数至少要增加1倍。

2.4 胚胎采集

胚胎在排卵后5 d 10 h到5 d 22 h进入子宫，子宫冲洗或胚胎回收可在排卵后的第6天进行，大多数学者认为在排卵后第6天收集胚胎的回收率较低，这可能与下列原因有关：（1）胚胎没有进入到子宫；（2）技术上失败；（3）没有发现胚胎因为直径小；（4）在处理过程中胚胎丧失。

通常用非手术法冲胚，在排卵后第7天收集胚胎，在冲胚前应对子宫和子宫颈的大小宽度有所估计，此外应当确定冲胚后是否立即需要用前列腺素处理，当母马有大于35 mm的卵泡时，前列腺素处理应被推迟，一般前列腺素处理被推迟48 h，这有助于子宫从冲洗后恢复过来增加下一次输精前正常发情周期的机率，子宫冲洗液一般选用Dulbeco's加1%的胎牛血清，有些学者认为用不用胎牛血清没有差别。胎牛血清是防止胚胎粘附在管壁或滤器上。冲胚时将直径1.5 cm Bivona管通入子宫，可将气囊注入30～50 ml空气，用2～3 L冲胚液对子宫进行冲洗，冲胚液被收集到平皿里，在实体显微镜下进行检胚。先用低倍显微镜找到胚胎，再用高倍显微镜评价胚胎等级。

2.5 胚胎质量鉴定

在体视镜下从冲卵液中回收胚胎，同时对胚胎的质量和活力进行评定或等级分类。

冲卵液温度为35～38℃，所有培养设备也都要事先预热达到35～38℃。

鉴定时主要观察胚胎的形态学特点，比如形状、色泽、卵裂球大小与均匀度、细胞密度、与透明带间隙以及细胞变性等情况。依据这些对胚胎进行质量分级，通常分为5级，1级最佳，5级为死亡的胚胎。3级或3级以上的发育正常的胚胎才能供移植或体外培养和保存使用。

2.6 胚胎的移植

2.6.1 手术法

有人认为手术法的效果好，但手术法耗费时间长，价格昂贵，需要更多的劳动力。

首次在科罗拉多进行的手术法胚胎移入方法是将母马用腹中线切口，在排卵同侧子宫角用断韧的针在血管少的子宫角处打孔，胚胎被装入一个玻璃管内连同少量的移胚液移入。现在手术法多采用腹侧壁肷窝处打孔。

人们建议将胚胎移入有黄体侧的即排卵同侧的子宫角，这样有利于孕酮对在妊娠前15～16 d游离状态的胚胎产生有益的影响。

2.6.2 非手术法

非手术法快捷、简便，而且成本低。非手术法移植有两种技术，现在应用很多。

技术A：胚胎被隔离在两段气栓和移植液中并被装在一个长约5.5 cm的输精管内，它与一个10 mL的注射器相连，将输精管用戴有消毒手套的食指引入子宫颈口将胚胎引入子宫体内，输精管外可套一个塑料外套。

技术B：胚胎被装入0.5 mL毛细管内，按0.2 mL储胚液+0.05 mL空气+0.1 mL储胚液+0.05 mL空气+0.1 mL储胚液顺序装入。

这些总体积不够装满整个毛细管所以在将毛细管装入移胚枪中后要将空气推出，助手将母马阴唇分开，术者用食指分开固定母马子宫颈口后，将橡胶套管插至子宫颈的一半位置并将输精插入子宫颈，术者将手移出阴道，伸入直肠把握排卵一侧子宫角，并将输精枪移到子宫角顶端推入。据报道技术A和技术B的受胎率相似，有工作者发现不同操作者对移植成功率的影响很大，母马的胚胎可分为1～5级，2级和3级胚胎获得的受胎率比1级低，母马的畸形胚胎出现的机率不大。