微球在牙体组织再生领域应用的研究进展

张 祎，赵 彬，王 璐，姚 蔚，郝凤翔，杨怡天

牙齿脱落是一个全球性的健康问题，由于细菌入侵、创伤或先天畸形，牙体组织容易失去部分甚至全部结构，不仅影响患者的咀嚼和美观，更影响其心理健康[1]。牙体组织包括釉质、牙本质、牙髓、牙骨质4种，在组织结构和生理功能上既相互独立，又彼此依存。由于酸蚀症、龋病、磨损等各种原因，常造成釉质、牙本质的脱矿或缺损。随着粘接技术和树脂材料的进步，美学树脂充填修复得到了越来越多的青睐。但是树脂充填存在树脂变色和脱落的问题，如果缺损范围过大无法进行充填治疗则需要行冠修复等牙体预备量更大的治疗，粘接面边缘容易发生微渗漏或者继发龋等，最终导致修复体的失败[2]。当龋坏进展到牙髓炎、根尖周炎时则需进行根管治疗，但治疗后的牙齿脆性增加，容易劈裂[3]。再生牙科作为一个新兴学科，研究基础是牙齿发育的潜在机制以及愈合修复的生物学过程，利用其自然愈合潜力，再生受损的组织结构[4]。组织工程作为再生学科的重要组成部分，使牙体组织的再生成为可能。

组织工程技术三要素分别为干细胞、支架以及生长因子。微球作为组织工程常用的载体形式，一般是指由可生物降解或可再吸收的高分子聚合物材料制备而成的实心或空心的微纳米级球形或类球形颗粒，属于基质-骨架型微粒[5]。有研究表明，与二维支架相比,在微球三维支架中培养的干细胞表现出更强的多向分化潜力[6-8]。微球根据制备时使用载体材料的不同可以分为天然有机高分子微球和合成有机高分子微球。微球的制备方法多样,包括静电喷雾法、乳化溶剂挥发法、相分离法等[9]。在生物学方面，微球制备所需的材料应无毒，具有良好的生物相容性，不影响被载物的理化特性及生物活性，有一定支撑力及可塑能力，在体内可完全降解等特性[10]。将具有长效缓释和靶向作用的微球作为物质载体，通过选择微球基质材料的种类，调控降解速度从而改变被载物释放速率，有效减少了突释并保护了被载物的生物活性[11]。因为牙体缺损通常较小且形状不规则，采用局部可用的微球作为组织修复的可注射细胞载体已经被广泛应用[12]。还可以将微球结合到可注射水凝胶中应用于组织工程，微球的加入不仅可以作为药物或生长因子的载体，调节细胞生长和组织再生，同时提高水凝胶的机械强度和孔隙率，有助于细胞粘附以及物质交换[13]。

1 微球与釉质再生

1.1 微球在釉质仿生再矿化中的应用

釉质的仿生再矿化是模仿釉质生物矿化的原理，在脱矿釉质晶体上实现类釉质晶体沉积，使釉质病损自愈性修复，达到与天然釉质相似的结构及功能[14]。在釉质龋发生的早期阶段加强再矿化是阻止病变进一步发展的关键。目前的研究主要集中在凝胶环境下诱导牙釉质再生用于临床再矿化。如Simeonov等[15]在壳聚糖水凝胶中加入了磷酸钙微球，研究壳聚糖/磷酸钙复合凝胶对脱矿牙釉质的再矿化作用效果，磷酸钙微球作为钙离子和磷酸盐离子的“储蓄库”，可以为脱矿釉质的仿生矿化提供充足的矿化离子。但用于釉质仿生再矿化的实验周期长，操作繁琐，通过再矿化再生的晶体有些是疏松多孔的，不能耐受咀嚼功能活动，限制了其广泛应用。此外，将天然釉质发生过程中细胞外基质蛋白及其衍生物或合成聚合物包裹于微球，加入水凝胶中，利用其与釉质发生过程中微环境相似的原理，诱导釉质再生，可以模拟釉质在体内的发生[16]。如Xiao等[17]利用嵌合肽介导羧甲基壳聚糖/无定形磷酸钙纳米复合物(CMC/ACP)模拟釉质生物矿化中釉原蛋白引导ACP定向组装，此实验研究表明嵌合肽可以引导降解的CMC/ACP纳米颗粒粒子与脱矿的牙釉质表面特异性结合，完成釉质样晶体的快速形成和仿生再矿化，在体外模拟体内矿化的过程，结果表明新形成的釉质晶体结构整齐且有良好的机械性能。

1.2 微球在釉质组织工程中的应用

到目前为止,还没有基于活细胞的釉质组织工程[18]，据报道，传代培养的Malassez上皮细胞在牙冠形成阶段可以分化为成釉细胞样细胞，并与牙髓细胞结合形成釉质样组织[19]。非牙源性人类上皮来源的细胞，如人表皮干细胞(human keratinocyte stem cells，HKSCs)、牙龈上皮细胞和多能干细胞等，与人或鼠胚胎牙间充质重组时，也可以分化为成釉细胞从而形成牙体组织[20]。成纤维细胞生长因子8(fibroblast growth factor 8，FGF8)和Shh(sonic hedgehog)蛋白已被证明可以支持牙齿形成和促进成釉细胞向分化。Hu等[21]将HKSCs与FGF8和Shh蛋白进行预处理后，与小鼠牙间充质细胞重组，形成嵌合牙胚，与载有FGF8和Shh的琼脂微球一同植入重组牙胚，在裸鼠肾被膜内进行培养，研究结果表明用FGF8和Shh处理HKSCs，可以有效地诱导干细胞向成釉细胞分化，并快速生成釉质，再生的牙釉质结构与正常釉质相似。这些结果为微球在釉质再生中的应用提供了实验依据。

2 微球与牙髓-牙本质复合体再生

牙体组织中的唯一软组织——牙髓，与硬组织牙本质在发育上同源，结构上紧密相连，功能上相互依存，共同构成牙髓-牙本质复合体结构。牙髓良好的血液供应是牙髓-牙本质复合体发挥生理功能的基础。由于牙髓血运只能从根端运输，根尖孔闭合后，血管入口很小(<1 mm)，根管狭窄且形态多变不规则严重限制了营养物质的扩散和血管的生长[22-23]。当受到外界刺激后，牙髓通过牙本质小管内的牙本质液感受刺激并作出相应反应，同时形成第三期牙本质即反应性牙本质，保护牙髓免受外界刺激和微生物的攻击，从而使牙髓组织长期存活，但是新形成的第三期牙本质中牙本质小管数量少且明显弯曲，与原有牙本质小管不相通[24-25]。基于牙髓-牙本质复合体特殊的解剖生理特点，微球载体更适合于牙髓-牙本质复合体的再生。

2.1 微球作为细胞载体在牙髓-牙本质复合体再生中的应用

微球作为干细胞输送载体在再生医学领域引起了人们的广泛关注，已有很多研究通过将干细胞负载在微球中成功地再生了牙髓-牙本质复合体。目前用于牙髓-牙本质复合体再生的干细胞主要有牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脱落乳牙干细胞(stem cell populations from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)、牙根尖乳头干细胞(dental papilla stem cells, SCAPs)和牙囊前体细胞等[26-29]。

其中,来源于牙髓组织或牙髓前体的DPSCs、SHEDs和SCAPs可能是更适合牙髓再生的细胞来源[30]。Yang等[31]利用甲基丙烯酰明胶(gelatin-methacryloyl, GelMA)优异的生物相容性和降解性，采用静电喷雾法制备了平均直径200 μm的DPSCs-GelMA的微球，DPSCs能在微球中增殖并且分泌细胞外基质蛋白。此外，载细胞的GelMA微球系统能够经受住低温保存。移植于裸鼠皮下后，载细胞的GelMA微球组与载细胞的GelMA块状组相比，形成了更多的血管化牙髓样组织，并有着合适的降解速率。研究表明GelMA微球作为细胞载体在牙髓再生中显示出优异的性能和巨大的潜力。Zhang等[32]采用静电微滴法制备了平均粒径为350～450 μm的可注射RGD-海藻酸盐/磷灰石水凝胶微球，其中包裹了DPSCs和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，细胞在微球中可形成细胞-基质相互作用。引入膨润土的微球在力学性能和缓释性能上都具有可调性，通过持续释放VEGF，可促进牙髓样组织的再生。结果表明这种水凝胶微球系统在富含微血管的牙髓再生中是一种很有前途的干细胞支架。Garzón等[33]用聚L-乳酸(Poly(L-lactide)acid，PLLA)分别制备了纤维表面微球和光滑表面微球两种可注射微球，将DPSCs分别与这两种微球结合，形成具有生物活性的可注射聚合物，在体内模型中检测它们促进牙髓再生的能力。研究结果表明，PLLA微球和DPSCs能够在体外和体内模型中促进牙髓再生，目前，基于干细胞的牙髓再生组织工程技术已经成为很有前途的根管治疗替代策略[34]。

此外将微球作为细胞载体的组织工程技术为牙本质的组织再生提供了新的思路。Kuang等[35]研发了一种新型可注射细胞载体用于牙本质再生，研究结果表明这种具有互连孔和纳米纤维的海绵微球，可以为牙髓干细胞的增殖分化和牙本质组织再生提供有利的微环境。Wang等[36]研发了一种载有生长因子的可注射细胞载体用于牙本质再生，通过将聚乳酸纳米纤维微球作为细胞载体，与载有骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)的聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)微球联合诱导SCAPs成牙分化，实验中有成牙本质细胞样细胞和牙本质样组织形成，但不具有典型的管状牙本质结构。研究结果表明，聚乳酸纳米纤维微球结合BMP-2的控制释放可以为SCAPs再生牙本质组织提供良好的微环境。

2.2 微球作为物质载体在牙髓-牙本质复合体再生中的应用

微球还可以直接作为载体，利用其靶向性和缓释控释特性，来运输各种生长因子、药物及基因等到达特定区域，被载物从微球载体中出来后按一定的释放速度缓慢释放，从而调节细胞生长和牙髓-牙本质复合体的再生。

目前用于牙髓再生的生长因子有转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子和其他血管生成因子等[37-38]。牙髓的活力依赖于血运循环，微循环保证了牙髓组织的正常生理功能，同时也是牙髓-牙本质复合体发育和再生的基础，通过狭窄的根尖孔建立有效血液循环是研究者面临的巨大挑战之一。VEGF作为促血管生成最有效的生长因子，在牙髓再生中的应用引起了很多研究学者的关注。为了评价载VEGF微球促进牙髓再生的作用，Li等[39]通过将VEGF与肝素结合，包裹在肝素偶联的明胶纳米微球中，这些纳米微球进一步固定在可注射的PLLA微球的纳米纤维中，作为一种层次化生长因子负载纳米纤维微球支架系统，不仅保护了VEGF不会变性和降解，而且提供了良好的缓释控释。此外，这种微球可以有效地容纳DPSCs并支持牙髓组织的形成。活体研究表明，大量的血管在整个根管中再生，首次证明了一端封闭的全长根管内牙髓组织再生的可行性。李祥伟等[40]将DPSCs与载VEGF微球经根尖孔注入根管腔,植入裸鼠背部皮下,9周后进行组织学和免疫组织化学观察,空白根管作为空白对照组。结果表明DPSCs可在载VEGF微球上生长和增殖；DPSCs和载VEGF微球组可在体内形成富含微血管的牙髓样组织，充满根管全长并达冠1/3,且伴成牙本质细胞样细胞分化。

目前被证实可用来促进牙本质再生的细胞因子有转化生长因子β超家族(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2、胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2、脑源性神经营养因子等[41-42]。有学者研制了一种含有转化生长因子-β1(TGF-β1)的壳聚糖纳米微球的羧甲基壳聚糖支架，通过释放在牙本质基质形成中起重要作用的TGF-β1,诱导成牙本质前体细胞分化[43]。Toledano等[44]将多西环素、钙离子及锌离子载于聚甲基丙烯酸甲酯纳米微球，并将其制备成凝胶用于治疗侵蚀性颈部牙本质损伤，研究结果表明载锌纳米微球凝胶可以促进牙本质矿化，为侵蚀的颈部牙本质再生和牙本质过敏症的有效治疗提供新的策略。Zhang等[45]通过合成地塞米松空心羟基磷灰石微球，建立了缓释体系。这种微球具有中空的核心和多孔的壳层结构，能以控释和缓释的方式释放活性物质，并可促进体外培养的牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，表现为碱性磷酸酶活性和牙源性分化相关基因表达上调，钙沉积增加。该实验研究表明地塞米松空心羟基磷灰石微球有望成为治疗深龋的潜在生物材料。

2.3 微球作为组织支架在牙髓-牙本质复合体再生中的应用

微球直接作为组织支架，不仅可以为细胞提供足够的附着部位，更好地促进了细胞的粘附，细胞及其细胞外基质的保存还能够提高移植细胞的存活率[46]。通过注射生物活性支架，降解后被天然细胞外基质取代，可以促进牙髓-牙本质复合体的再生[47-48]。如Zou 等[49]采用复乳溶剂萃取法制备PLGA微球支架，进行Ⅰ型胶原表面修饰后，与分离出的DPSCs共培养，8周后发现牙髓干细胞粘附于微球表面并增殖分化为成牙本质细胞样细胞，与基质矿化形成了三维复合体，研究结果表明这种可注射的PLGA微球支架可能适合牙髓牙本质复合体的再生。张璇等[50]通过乳化交联法制备了适宜牙髓-牙本质复合体再生的透明质酸(hyaluronic acid,HA)微球支架，将牙髓干细胞负载于HA微球表面进行牙髓再生，研究表明这种方法可以解决支架材料降解周期过长而占据根管空间阻碍再生牙髓组织进一步生长的问题，这种微球支架可作为种子细胞支架促进DPSCs的增殖和分化。Qian等[51]采用复乳法和溶剂挥发法制备了二氧化硅/β-磷酸三钙/聚乳酸-羟基乙酸共聚微球，将这种微球与DPSCs共同培养，实验结果证实该微球能促进成纤维细胞的生长，且具有良好的生物相容性。微球支架结构和二氧化硅共同促进了牙髓干细胞的迁移分化、血管形成和胶原纤维的形成，有望用于牙髓-牙本质复合体的再生工程。王冠华等[52]将DPSCs接种于可注射PLGA微球支架上，发现细胞可在微球支架上良好生长，体外培养8周后，微球支架上有基质样物质的沉积和部分支架降解，研究结果表明该微球支架可用于牙髓-牙本质复合体再生。

3 微球与牙骨质再生

目前关于牙骨质再生的研究主要集中在干细胞、合适的支架和生长因子的结合，以及不同类型的移植技术上，用于牙骨质再生的干细胞有牙周膜干细胞、牙囊细胞、骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞等[53]。影响牙骨质再生的生物因子有釉基质衍生物、转化生长因子β超家族、胰岛素样生长因子、牙骨质蛋白1重组蛋白、脑源性神经营养因子等[54-55]。

组织工程支架可以为牙骨质再生提供合适的微环境，目前用于牙骨质再生的支架结构的最新进展包括多相和三维打印支架和水凝胶[56]。例如Cho等[57]通过3D打印技术制备了聚己内酯支架，并在支架中分别加入包裹结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、BMP-2或BMP-7的PLGA微球。将有牙周膜干细胞负载的支架放置在裸露的牙本质表面。在成牙骨质/成骨培养基中培养6周后，评价牙骨质的形成和整合，研究结果表明与对照组相比，所有生长因子注射组均出现新形成的牙骨质样层，BMP-2和BMP-7组新生牙骨质层的厚度大于所有其他组，而CTGF和BMP-7组牙本质表面的整合度优于其他组，且BMP-7处理后的新生矿化组织层表达出牙骨质蛋白1。虽然本实验成功再生了牙骨质样组织，但是新生的牙骨质不具备功能特征而且缺乏与周围组织的整合。牙骨质作为平行于根部牙本质表面的薄层片状矿化组织，由于其中有牙周膜Sharpey纤维嵌入，再生过程中需要在不同的硬组织和软组织界面上进行一系列的协调反应，因此牙骨质的成功再生仍然是一个具有挑战性的课题。迄今为止，牙骨质再生的组织工程研究仍处于初步阶段。

4 前景与挑战

组织工程技术主要策略是干细胞种子支架策略，即在体外将干细胞接种于支架上，然后将其移植到特定组织中。第二种策略称为细胞归巢策略，将负载信号分子的支架植入靶组织，将内源性宿主干细胞招募到植入部位，诱导其进行组织再生。第三种策略是直接将干细胞注射到损伤部位，启动组织再生。用于牙体组织再生的微球，可以分别或联合应用以上策略再生出牙体组织，在组织工程和再生医学中有广阔的应用前景。为了形成与天然牙完全相同的组织结构，还可以将所需形状的支架设计与计算机辅助设计和计算机辅助制造技术、3D打印等先进数字技术相结合，这在不久的将来可能成为现实。

但是组织工程中的微球缓释系统不适用于生物半衰期很短或很长、有效剂量较高或溶解度较低的药物。对于微球在体内以何种降解途径降解，如何获得微球可控制的降解速度使之与牙体组织再生速度相匹配，如何消除微球降解产物对局部微环境的影响等一系列问题仍需要进一步继续研究。此外，随着科学技术的不断进步，微球的制备技术也会越来越先进，相信在不久的将来微球在牙体组织再生领域应用会更加广泛。