ACMG基因变异分类指南在聋病遗传咨询临床教学中的应用

关静 王洪阳 吴萧男 李进 王大勇 王秋菊

中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部耳鼻咽喉内科(北京 100853)

国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心(北京 100853)

遗传性耳聋具有显著的遗传异质性，涵盖全部孟德尔遗传方式，高通量基因测序技术已成为临床医生进行聋病遗传诊断的重要手段。但随着测序技术覆盖的基因数目增加，检测发现基因的新变异越来越多，且部分新变异与疾病的相关性还缺乏足够的文献及生物信息数据库支持，从而也为开展聋病遗传咨询带来挑战。对于临床医生如何解读基因报告并对检测结果进行合理的分析和解释，是临床咨询决策的关键。在聋病遗传咨询的临床教学实践中，我们将2015年ACMG发布基因变异分类指南与不同典型案例结合示教，以期为临床医生解读基因变异的临床意义及开展相应的遗传咨询提供参考。

1 基因检测报告的基本组成

在临床遗传咨询工作中，我们能看到不同的医学检验实验室或临床检验中心编写的基因检测报告，尽管格式及篇幅不尽相同，但是都含有6项基本条目内容：样本信息、检测信息、检测结果、结果说明、参考资料、附录。

1.1 样本信息

体现了遗传咨询检测前采集到的患者部分临床信息，如：样本的个人信息（若同时有家系样本则同时列出家系样本信息及关系）、临床表型特征及家族史、样本类型（外周血/DNA）、样本编号（根据不同检测机构的编号规则）、送检日期。受检者的表型特征及家族史对于基因检测结果的分析和解读十分重要，近年来在大多基因报告的表型信息中有使用“人类表型标准用语联盟（Human Phenotype Ontology,HPO）”提供的标准医学术语对受检者表型特征进行匹配描述，如：感音神经性听力障碍（HP:0008527）、重度耳聋（HP：0012714）等。

1.2 检测信息

标明了样本的测序项目，如：单个耳聋基因检测、遗传性耳聋基因包检测、全外显子组检测、线粒体基因组检测、基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV）检测；以及基因检测的实验方法，如：目标区域捕获高通量测序、芯片捕获高通量测序、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-de-pendent probe amplification,MLPA）、全基因组CNV检测、Sanger测序等。由临床医生根据受检者资料来建议送检的测序项目。

1.3 检测结果

如果发现可能的相关变异，基因报告中对变异的描述是根据人类基因组变异协会（the Human Genome Variation Society,HGVS）的命名规则来报告，包括：基因名称、基因变异信息（转录本编号、核苷酸和氨基酸变化）、基因亚区、基因型（杂合/纯合/半合子）、致病性分类（已知致病/疑似致病/意义不明确/可能良性/良性）、相关疾病名称、遗传模式、变异来源（父源/母源）等。如果未检测到与受检者临床表型相关的致病/疑似致病/遗传模式相符的临床意义未明变异等，在结果列表的各项中常用“-”填写。

1.4 结果说明

检测到的变异是否已有报道，该变异分类的证据说明，基因变异是否可以全部或部分地解释患者的临床表型。这部分信息可为临床医生提供必要的信息，以帮助其决定是否需要补充临床其他检查。

1.5 参考资料

列出对变异结果分类时所引用的相关参考文献、数据库及预测软件等。

1.6 附录

检测基因列表、检测方法的局限性、测序参数、检测结果相关附图等。

2 基因变异分类及案例解读应用

ACMG制定的系列基因变异致病分类指南，对于单核苷酸变异、线粒体变异、拷贝数变异等遗传变异都可用“五级分类法”，即：致病、可疑致病、意义不明确、可能良性、良性[1]。我们已将2015年ACMG英文指南翻译成中文版，并于2017年6月发表在《中国科学：生命科学》杂志[2]，以帮助国内同行更加准确和规范地进行基因变异解读。本文也是应用2015年ACMG发布的遗传变异分类标准与指南内容，主要对临床案例中检测到的孟德尔遗传变异进行解读分析。

指南中在“致病”或“可疑致病”变异的分类标准中，列有16条致病性证据：非常强（PVS1）、强（PS1～4）、中等（PM1～6）、辅助证据（PP1～5）；在“良性”或“可能良性”变异的分类标准中，列有11条良性影响证据：独立证据（BA1）、强（BS1～4）、辅助证据（BP1～6）。需要注意的是括弧中的数字不表示分类差异，仅指代不同规则条目。根据遗传变异分类联合标准规则，将证据条目进行相应地组合，从而得到一种变异分类结果（具体内容详见中/英文指南）。本文将分别通过3个实际案例，演示如何解读基因报告及相关临床应用。

2.1 致病变异（pathogenic variants,P）

基因报告中列出的变异为“致病”时，通常表明受检者的临床信息（包括家族史、遗传方式等）与变异基因相关的疾病表型高度相符，或是已有该变异致病性的相关报道。致病性变异具有较明确的临床指导意义，因此可以根据该基因变异的相关遗传模式及表型特征来开展聋病遗传咨询工作。

案例1：患儿，女，5岁，临床诊断“大前庭水管综合征（LVAS）”，无耳聋家族史。经全外显子组测序检测到SLC26A4基因的两个致病性变异位点，通过双亲验证也明确了这两个变异分别来自双亲，患儿基因型为SLC26A4复合杂合变异：c.919-2A>G（母源）+c.1975G>C（p.Val659Leu）（父源）。

患儿两个变异位点的致病证据，不仅都有相同变异致病性的文献报道，同时根据ACMG指南标准：①SLC26A4c.919-2A>G为经典±1或2的剪接突变相关的无功能变异（PVS1）；在隐性遗传病中，经父母验证显示等位基因反式位置上存在致病变异，且与多个已知致病变异均呈反式排列（PM3_Very Strong）；突变与疾病在家系中共分离（PP1）；基因变异表型支持（PP4）；该位点的证据组合为PVS1+PM3_Very Strong+PP1+PP4，分类符合“致病变异”。②SLC26A4c.1975G>C位于热点突变区域，是已知无良性变异的关键功能域（PM1）；千人数据库、ESP数据库、EXAC数据库中正常对照人群中极低频位点（PM2）;在隐性遗传病中，经父母验证显示等位基因的反式位置上存在致病变异，且与多个已知致病变异均呈反式排列（PM3_Very Strong）；基因变异表型支持（PP4）；该位点的证据组合为PM1+PM2+PM3_Very Strong+PP4，分类符合“致病变异”。

遗传咨询建议：SLC26A4突变患者可以表现为典型LVAS，而部分LVAS患者在青春期后可能出现甲状腺肿（即为Pendred综合征）。患儿成长过程中，建议每两年评估甲状腺功能状态，以早期发现及时治疗。患儿明确为常染色体隐性遗传性疾病，父母为SLC26A4致病突变携带者，该家庭再生育疾病患儿的发生风险较高（约25%），如有再育计划，孕前及产前的遗传咨询指导很重要。

2.2 疑似致病变异（likely pathogenic variants,LP）

本指南中没有对“疑似致病”量化的定义，但通常是用来说明一个具有大于90%可能引起致病的变异，是要求有较强的致病证据。这类变异可能有助于解释临床，或是具有潜在临床指导意义的变异。但要确定检出的变异是致病性之前，需要将全部的证据汇集在一起，包括所有已报道的案例分析，最后谨慎得出分类结论。

案例2：患者，男，12岁，发现双耳听力下降5年，临床诊断“感音神经性耳聋（双，中度-缓降型）”，其母亲及姥姥的双耳均听力异常（母亲31岁：双耳中度缓降型、19岁发病，姥姥52岁：双耳极重度平坦型、20岁发病），子孙三代均为独子、无其他兄弟姐妹。经全外显子组测序检测到常染色体显性耳聋综合征（甲状旁腺功能减退-耳聋-肾发育不良综合征，HDR）相关的GATA3基因1个疑似致病变异位点，通过家系验证明确患儿母亲和姥姥均携带该变异，患儿基因型为GATA3杂合变异：c.826C>T（p.Arg276Ter）。

该变异位点的致病证据，包括在一个欧洲HDR综合征家系中曾有相同变异致病性报道，同时根据ACMG指南标准：HDR致病机制为功能丧失（LOF）,而本例患者携带的变异为无义突变（PVS1）；千人数据库、ESP数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现该变异（PM2）；该位点的证据组合为PVS1+PM2，分类符合“疑似致病变异”。

遗传咨询建议：先证者检测到GATA3基因1个可疑致病变异，该基因导致的表型为甲状旁腺功能减退-耳聋-肾发育不良综合征，这个家族中携带该基因变异的患者或成员均建议完善肾脏B超、肾功能、甲状旁腺功能等检查；HDR呈常染色体显性遗传方式，患者后代有高达50%的发病风险，患儿未来有婚育计划时遗传咨询也很重要。

对这个家系案例，我们进行了短期随访。基因结果提示先证者及其母亲、姥姥等3人均携带GATA3可疑致病变异，基于基因相关HDR表型特征，我们建议3人进一步完善了甲状旁腺功能（iPTH）、肾功、肾脏B超及血清钙/磷等检测，以明确是否存在其他相关系统异常。临床检查结果显示：先证者姥姥未见异常结果，但检测到先证者左侧肾缺如、先证者和其母亲的血清钙均低于正常值（2.02-2.60 mmol/L）分别是1.69↓mmol/L和1.92↓mmol/L。先证者及其母已有低钙血症指标，尽管没有出现手足抽搐等症状，但需要适当补充钙剂或维生素D，定期监测血钙、iPTH值及肾功能状态，预防并发症。

相对来说，常染色体显性遗传是遗传咨询中最简单的模式，但在解读疑似致病变异携带者与临床表型时，还应适时地考虑到发病年龄差异、外显不全、表现度差异等问题。

2.3 意义不明确的变异（variants of unknown sig-nificance，VUS）

基因检测报告中的“意义不明确”变异，给临床医生的决策产生了困扰和难题。这类变异是临床指导意义不肯定，且又不能排除其临床相关性。对于有科研条件的团队，应该尽可能地完善患者表型信息、开展基因检测数据再分析、增加父母样本验证、寻找变异与疾病在家系共分离的证据或必要的体外功能实验等。通过努力挖掘相关证据，若将VUS变异分类能提升为“疑似致病”或下调为“可能良性”，才能对临床解读提供依据；否则，“意义不明确”变异不宜用于临床决策，在对患者家庭人员解读咨询时需要更加谨慎。

案例3：患儿，女，2岁，新生儿听力筛查双耳未通过，临床诊断“感音神经性耳聋（双，极重度）”，1.5岁行左侧人工耳蜗植入术。经全外显子组测序检测到MYO15A基因两个“意义未明”变异位点，通过双亲验证也明确了这两个变异分别来自双亲，患儿基因型为MYO15A复合杂合变异：c.4190C>A（p.Ser1397Tyr）（父源）+c.9888_9898delinsTCGGGGGG（p.Leu3297_Gln3300delinsArgGlyGlu）（母源）。

患儿的这两个变异位点均没有致病性的相关报道，同时根据ACMG指南标准：①MYO15Ac.4190C>A仅有一个证据，即：在千人数据库、ESP数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现变异（PM2），分类符合“意义不明确”。②MYO15Ac.9888_9898delinsTCGGGGGG在千人数据库、ESP数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现变异（PM2）；该变异是非重复区框内插入/缺失导致蛋白质长度变化（PM4）,该位点的证据组合为PM2+PM4，分类符合“意义不明确”。

MYO15A基因是较常见的常染色体隐性遗传非综合征型耳聋基因，该基因相关患者听力损失表型以先天性双耳全频重度或极重度感音神经性耳聋为主，但也有迟发型或中高频下降型或中重度听力损失等表型异质性，而这类表型不具有特殊性，多种基因变异都有可能与之关联。因此，当本例患儿检测到“意义不明确”的MYO15A复合杂合变异时，我们是不能根据这个复合杂合变异基因型来解释其“先天性极重度感音神经性耳聋”的病因，更不能以此结果对这个家庭进行再生育风险评估。

但对于报告中主要指征的基因中存在临床意义不明的变异，建议医生及相关遗传咨询人员定期查询其不明意义的变异结果是否随着新的变异证据增加而有变异分类的调整。

2.4 可能良性变异（likely benign variants，LB）

与“疑似致病”的定义类似，“可能良性”通常是说明一个具有大于90%可能为良性的变异。这类变异与患者的部分或全部临床表型无关，没有实际临床指导意义。

2.5 良性变异（benign variants，B）

良性变异是明确不具有临床相关性的变异，因此无法提供遗传咨询和临床决策。

3 聋病遗传咨询临床教学总结

遗传咨询是帮助咨询者理解遗传因素对疾病的作用，解释基因检测结果及其在疾病诊断、治疗和预后上的意义，告知遗传方式和预测遗传风险的交流沟通过程。每个家庭的情况不同，提出的咨询问题也不同[3,4]。ACMG基因变异分类指南为我们了解检测报告中变异的定性分类提供了重要的理论参考，当变异为“致病”或“疑似致病”时，我们需要根据变异基因的遗传模式并结合患者及其直系亲属的表型特征，进行基因检测结果的解读及提供相关的遗传咨询建议；“意义不明确”变异是不宜用于临床决策，同时对患者家庭人员解读时也需要十分谨慎；对于“可能良性”或“良性”变异，无法提供遗传咨询和临床决策。本文因篇幅所限，仅以3个案例来解读“致病”、“疑似致病”、“意义不明确”变异在临床中的指导意义，期望对临床医生在理解基因检测报告内容及开展相关聋病遗传咨询工作等方面，能提供些许的参考和帮助。