长链非编码RNA在结直肠癌中的诊断价值和作用机制

任俊 吴敬 金田力 付涛

研究表明,长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的异常表达和突变在CRC的发生和发展中具有重要作用。lncRNA通常被定义为超过200个核苷酸的非编码RNA(ncRNA)，这类隐性非编码RNA在癌症中起主要的致癌或抑癌作用。我们对lncRNA在CRC中的诊断价值及作用进行综述。

一、lncRNA在CRC中的诊断价值

越来越多的lncRNA被报道为CRC诊断的标志物，由于其组织特异性，lncRNA可能比目前的DNA、蛋白质编码RNA或蛋白质生物标记物等标记物更敏感。如CCAT1在CRC中显著过表达，在癌前组织中的表达也明显上调，基于其在CRC中独特的表达特点，CCAT1已被确定为筛查癌前病变的潜在生物标志物及治疗靶点[1]。有研究证实，SNHG11作为一种新的早期生物标志物用于CRC的诊断及预后预测[2]。另有学者将HOTAIRM1的诊断价值与CEA、CA199和CA125进行了比较，与CA199和CA125相比，HOTAIRM1诊断的可靠性更高，将HOTAIRM1与CEA结合使用可显著提高敏感性和特异性[3]。在对晚期CRC病人的HOTTIP，PVT1和UCA1的综合研究中，HOTTIP/PVT1/UCA1筛查与总体生存期相关，可作为预测性筛查，在晚期CRC病人筛查中具有出色的诊断性能[4]。此外，在血清、血浆和外周血单个核细胞等外周血中也可以检测到lncRNA。因此，循环中的lncRNA可能成为肿瘤诊断的非侵入性分子标志物[5]。因此，lncRNA可被认为是CRC病人中有希望的诊断生物标志物，联合检测的诊断率和敏感度更高。

二、lncRNAs在CRC中的作用

1.lncRNA与CRC细胞凋亡与逃逸：有多项研究描述了lncRNA在细胞周期阻滞和凋亡中的调控作用。研究表明，DQ786243在CRC组织和癌旁正常组织中存在差异表达。体外实验证明，DQ786243基因的敲除可抑制细胞增殖、侵袭和迁移。此外，DQ786243被认为与细胞凋亡和细胞周期进程有关[6]。另一项研究发现，CCAT2在CRC组织中明显高表达，且与CRC病人预后不良相关，CCAT2能促进CRC细胞的生长增殖，抑制细胞凋亡[7]。研究显示，LINC00346在CRC组织和细胞中显著上调，过表达LINC00346可上调JAK1/JAK1和p-STAT3/STAT3的表达水平，显著提高HT29和LoVo细胞的OD450值和菌落数量，降低凋亡率，上调Bcl-2，下调Caspase-3和Bax。敲除LINC00346对HT29和LoVo细胞的增殖和凋亡作用相反，沉默 LINC00346可通过抑制JAK1/STAT3信号通路抑制CRC细胞增殖，促进细胞凋亡[8]。Shi等[9]研究表明，BANCR在CRC中低表达，在SW480和HCT116细胞中，BANCR通过促进G1期阻滞和引起p21介导的凋亡影响细胞增殖。另一项研究证实，人CRC组织和CRC细胞系中的Loc554202低于正常对照组，Loc554202可能为一个有潜力的抑癌基因。通过转染pCDNA-Loc554202后，S期细胞明显减少，凋亡细胞比例明显增加。特异性半胱天冬酶裂解级联的激活是Loc554202诱导CRC细胞凋亡的原因之一[10]。

2.lncRNAs与肿瘤血管生成：恶性肿瘤中的血管生成是肿瘤生长所必需的，也是转移途径中的一个重要因素。研究表明，lncRNA在血管生成中起着关键作用[11]。研究表明，lncRNA母系表达基因3(MEG3)在包括CRC在内的多种肿瘤中表达水平较低，MEG3过表达在体内外均能抑制CRC细胞的增殖[12]。此外，MEG3的过表达不仅抑制血管内皮细胞的增殖，而且对血管内皮细胞的增殖和血管生成也有负面影响。 MALAT1在体外和体内被证明具有促进血管生成的作用[13]。有研究表明，转染MALAT1 siRNA或Gapmers的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)出芽及细胞迁移率明显增加。此外，在MALAT1-/-小鼠模型中，观察到MALAT1通过调节血管密度、血管扩张和血流恢复来激活血管生成[14]。通过使用下一代核糖核酸测序和微阵列分析NORAD在缺氧条件下通过miR-590-3p调控人脐静脉内皮细胞的血管生成。NORAD/miR-590-3p轴可能是HUVECs血管生成机制中的一种新的调控途径，这为治疗缺血/缺氧诱导的血管生成疾病包括肿瘤疾病提供了一个潜在的新视角[15]。因此，基于lncRNA的治疗策略在调节组织血管化方面具有很大的应用前景，并可用于CRC的防治。

3.lncRNA在细胞周期中的作用：大量研究已经证实了lncRNA在CRC细胞周期和细胞凋亡中的作用。最近，报道了一种新型的lncRNA IQCJSCHIP1反义RNA 1(IQCJ-SCHIP1-AS1)功能。相对于对照，CRC组织显示IQCJ-SCHIP1-AS1表达下降两倍以上。IQCJ-SCHIP1-AS1的抑制与不良预后和通过控制细胞周期和细胞凋亡率增加细胞增殖相关[16]。lncRNA p53是癌症中一个有据可查的抑癌基因，也被称为“基因组守护者”，它调节DNA修复，细胞周期停滞和细胞凋亡。它通过促凋亡蛋白(例如PUMA，FAS和ndBAX)驱动凋亡。而且，p53通过诱导p21阻断CDKs(细胞周期蛋白依赖性激酶)而启动细胞周期停滞。研究表明，lncRNA小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)通过影响CRC细胞中p53及其靶标的蛋白水平，减少了G0/ G1期的细胞凋亡和调控细胞周期停滞[17]。此外，研究发现lncRNA MLK7反义RNA 1(MLK7 AS1)是一种新的预后因子，与CRC的肿瘤发生有关。据推测，MLK7 AS1的过表达通过下调CRC细胞中p21的表达启动细胞周期停滞来促进肿瘤生长和细胞增殖[18]。最近又发现LncRNA STEAP3-AS1在结肠癌组织和细胞系中显著增加,STEPA3-AS1高表达与结肠癌病人总体生存率低有关，其通过STEAP3影响CDKN1C表达调控结肠癌细胞周期进程。在体外实验中，STEAP3-AS1基因敲除可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移，并使结肠癌细胞阻滞在G0-G1期，其机制在于STEAP3-AS1的下调可通过上调STEAP3上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1C(CDKN1C)的表达[19]。研究显示，NR2F2-AS1在CRC中表达上调，NR2F2-AS1表达水平高的CRC病人总体生存率较低。Cyclin D1在CRC中也有上调，且Cyclin D1与NR2F2-AS1呈正相关。NR2F2-AS1沉默介导Cyclin D1下调，诱导CRC细胞G0/G1期阻滞[20]。研究表明，ZFAS1是CRC中的癌基因。ZFAS1可能通过破坏p53稳定性与CDK1/cyclin B1复合物的相互作用影响细胞周期进程和抑制凋亡，增强CRC的癌变作用[21]。总之，lncRNAs可以通过调节p53、p21，抗凋亡和促凋亡蛋白等关键蛋白来控制细胞周期和凋亡。

4.lncRNAs和EMT：EMT是原发肿瘤细胞获得迁移和转移能力的潜在驱动力之一。大量的lncRNA被报道参与EMT进程的调节[22]。如lncRNA KIAA0125被显着抑制并且与CRC组织和细胞系中的细胞生长和侵袭有关。已发现异位过表达的KIAA0125通过调节CRC中的Wnt/β-catenin信号传导来阻止EMT[23]。锌指增强子结合蛋白1/2(ZEB1/2)的过度表达通过EMT进程的激活促进波形蛋白的转录与E-钙粘蛋白转录的抑制。据报道，高BANCR表达组比低BANCR表达组更严重的淋巴结转移相关。为进一步了解其内在机制，Fu等在HCT116细胞和Caco-2细胞中检测E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达，结果显示BANCR通过抑制波形蛋白的表达和促进E-钙粘蛋白的表达来诱导EMT表型[24]。Chen等[25]采用Western blot分析了EMT相关基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Snail-1)的表达，研究发现SNHG16的敲除导致E-cadherin显著上调，Vimentin，N-cadherin和Snail-1显著下调。免疫荧光结果显示，SNHG16基因的敲除促进了E-cadherin的表达水平，而减弱了N-cadherin的表达水平。SNHG16基因的敲除减弱了CRC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。

Chen等[26]研究发现，ADAMTS9-AS1水平与TNM分期、淋巴结浸润及较差的生存预后相关。缺失ADAMTS9-AS1可显著抑制细胞增殖、G1/S过渡、迁移和侵袭和EMT进程，ADAMTS9-AS1可能是一个有潜在的治疗靶点和预后因子。HOTAIR在结直肠癌组织和细胞系中均高表达，提示其在结直肠癌中具有调节作用。HOTAIR基因的敲除抑制了结直肠癌细胞的体外活力、迁移、侵袭和EMT，抑制了裸鼠结直肠癌的增殖和转移。进一步研究发现HOTAIR通过招募转录因子SNAIL抑制HNF4α，而过表达HNF4α可抑制CRC细胞的活力、迁移、侵袭和EMT[27]。lncRNA是被证明对CRC病人EMT相关基因有调节作用，是EMT的主要调节因子和不良结局的预测因子，但其机制还没有被充分研究。

5.lncRNA在CRC细胞DNA损伤反应中的作用：lncRNA可以通过调节不同的基因来调节DNA损伤反应，DNA损伤反应作为一个多功能的信号过程被激活，参与DNA损伤修复、细胞周期检查点和细胞去向的因子，从而驱动肿瘤发生。例如作为一种转录因子，P53负责周期阻滞、DNA修复和细胞凋亡，从而限制癌症的发展[28]。研究表明，DNA损伤以p53依赖的方式刺激lncRNA-MeG3的表达。因此，当Meg3沉默时，MDM2和p53之间的相互作用和p53的降解减少。最终，p53靶基因的表达被诱导。这些事件导致p53信号激活、DNA修复、细胞周期停滞和凋亡[29]。p53诱导的非编码RNA(PINCR)已被证明通过调节p53靶向基因(包括在G1阻滞和凋亡中)而在DNA损伤暴露中过表达。研究表明PINCR直接由p53诱导，并且通过对Matrin3进行海绵化来响应CRC中的DNA损伤而发挥了其作用[30]。Matrin3是高度保守的核蛋白，有助于RNA代谢和DNA修复(通过使复合物与RAD51结合)。已经证明，Matrin3的细胞内消耗导致DNA损伤和放射疗法敏感性的升高[31]。

Liu等[32]研究证实，lncRNA-RI与CRC细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关。lncRNA-RI通过与miR-4727-5p的竞争结合调节LIG4的表达，参与DNA损伤修复，影响细胞周期和辐射敏感性,他们认为lncRNA-RI是一个重要的CRC治疗靶点，它的敲除可以抑制肿瘤细胞的DNA损伤修复能力。此外，lncRNA、BRAF激活的非编码RNA(BANCR)在CRC中表达上调，与肿瘤的发生和化疗耐药有关。有研究认为，BANCR通过海绵吸附miR-203，通过上调CRC中CSE1L来增强DNA修复反应，从而发挥其作用[33]。以上数据证明了lncRNA在CRC肿瘤发生中的重要作用。

6.lncRNA在CRC表观遗传学中的作用:lncRNA不仅通过上述机制参与CRC肿瘤进程的调节，其在CRC表观遗传上也有重要作用。Zhi等[34]研究表明，肿瘤抑制物lncRNA脑源性神经营养因子反义(BDNFAS)被显着下调，与CRC组织和细胞系中GSK-3β的表达呈负相关。这表明BDNFAS的诱导通过阻断GSK-3β的表达来阻止细胞增殖和侵袭。抑制GSK-3β募集的EZH2和随后的H3K27me3，使CRC中的GSK-3β启动子沉默。GSK-3β是Wnt/β-catenin，PI3K/PTEN/AKT和Notch信号通路的下游组成部分，在DNA修复，碱基切除修复和双链断裂修复中具有主要功能。在另一个例子中，lncRNA HOXD簇反义RNA1(HOXD-AS1)被阐明在CRC中被下调，并与CRC病人的不良预后相关，其通过控制PRC2来下调HOXD3，从而在HOXD3启动子上积累H3K27me3，从而激活MAPK / AKT信号通路[35]。

在另一项研究中，在CRC组织中lncRNA ST3Gal6反义1(ST3Gal6-AS1)被下调，ST3Gal6-AS1通过将组蛋白甲基转移酶MLL1募集到调节α-2、3唾液酸化并阻断PI3K/Akt信号传导的ST3Gal6启动子来激活唾液酸转移酶ST3Gal6。因此，ST3Gal6-AS1使Foxo1核化并驱动CRC细胞中的发生[36]。Kunitoshi等发现从PVT1位点转录的PVT1 lncRNA的高表达与II和III期CRC病人的低生存率相关。PVT1基因异常甲基化与相应的PVT1 lncRNA表达降低及MYC基因表达呈负相关。对CRC转录本的生物信息学分析表明，PVT1位点还可能广泛影响与CRC相关的两条关键信号通路TGFβ/SMAD 和Wnt/βCatenin其他关键基因的表达和功能。PVT1是一种新的MYC致癌增强子，其活性受CRC异常甲基化介导的表观遗传调控[37]。lncRNA介导的表观遗传失调在很大程度上决定了基因的异常表达，并且表观遗传失调具有高度的物种特异性。分析管道可以有效地揭示表观遗传失调的癌症和细胞特异性模块，这些模块可能为识别表观遗传失调的诊断、治疗和预后靶点提供新的线索。

三、CRC中lncRNA的预后价值

有研究表明，lncRNA异常表达可能与CRC病人的不良预后和临床病理特征恶化有关。如与健康对照组比较，在非转移性CRC中血清外H19，HULC和HOTTIP被下调。此外，HOTTIP表达水平与不良的总生存率显着相关。此外，多因素分析证实，HOTTIP是CRC病人独立预后因素[38]。另有研究表明，lncRNA MIR4435-2HG的过表达与不良的临床病理特征(如TNM分期和CEA水平)相关。此外，相对于邻近的正常组织，高水平的MIR4435-2HG病人表现出无进展生存期和总体生存率下降[39]。综上所述，除了诊断价值外，lncRNA在CRC病人中显示出较高的预后预测价值，在临床病理学评估中可用作预后生物标志物。

四、展望

最近，在CRC中广泛发现了lncRNA在多种细胞和生物学过程中的作用以及肿瘤发生和转移。大量研究表明，lncRNA的异常表达已通过不同的方式在CRC中被调节，如细胞凋亡与逃逸、血管生成、细胞周期、上皮-间充质转化(EMT)、DNA损伤修复以及表观遗传学等，另外其有大量的潜在功能及作用机制需要进一步探索。